Ligation sequencing gDNA V14 — human sample (N50 10 kb) on PromethION (SQK-LSK114)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing gDNA V14 — human sample (N50 10 kb) on PromethION (SQK-LSK114) V GDH_9173_v114_revP_10Nov2022

  • This protocol uses N50 of 10 kb genomic DNA extracted from human cell lines
  • Sample preparation time: ~220 minutes and library preparation time: ~60 minutes
  • Data analysis: 1-2 hours
  • No PCR
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

  • This protocol uses N50 of 10 kb genomic DNA extracted from human cell lines
  • Sample preparation time: ~220 minutes and library preparation time: ~60 minutes
  • Data analysis: 1-2 hours
  • No PCR
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: GDH_9173_v114_revP_10Nov2022

1. Overview of the protocol

Introduction to the protocol for sequencing 10 kb human DNA on PromethION using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

This protocol describes an end-to-end process to prepare, sequence gDNA from cultured cells samples and analyse using the “Human variant workflow” in Epi2Me. The identification of structural variants (SVs) and single nucleotide variants (SNVs) play a pivotal role in our understanding of genetic diversity, disease mechanisms, and evolutionary biology1,2. The protocol aims to produce libraries with a read N50 ~10 kb and generate ~30-40x coverage of the genome, to provide robust calling of small and large variants as well as provide methylation and phasing information.

Briefly, genomic DNA is extracted from 5 million cultured cells, and is extracted using the QIAGEN Puregene Cell Kit. DNA is then sheared with the Covaris g-TUBE™, and libraries prepared with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). Libraries are then sequenced on PromethION.

Data is basecalled and aligned by MinKNOW and the aligned BAM output data is analysed using the wf-human-variation workflow which uses Sniffles2, Clair3 and modbam2bed software to call structural variants (SVs), single nucleotide polymorphisms (SNPs) and for reporting DNA methylation.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your input sample (cells)
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment, and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Sample preparation

Using the outlined extraction method, extract the gDNA from your cells, and fragment your gDNA using the Covaris g-TUBE.

Check the length, quantity and purity of your extracted material. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.


Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
DNA repair and end-prep Repair and prepare the DNA ends for adapter attachment 35 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the DNA ends 20 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

10 kb lsk114 workflow prom v2

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads.
  • Analyse data using the wf-human-variation workflow.
IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

Material
  • (FOR EXTRACTION) 5 x 10⁶ cells (e.g. cell culture or tissue sample)
  • (FOR LIBRARY PREPARATION) 1 µg of fragmented gDNA
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) (kit de secuenciación por ligación V14)
Consumibles
  • Celda de flujo PromethION
  • NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7672S o E7672L)
  • Puregene Cell Kit (QIAGEN, 158043)
  • g-TUBE™ (Covaris, 520079)
  • 15 ml Falcon tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Isopropanol, 100% (Fisher, 10723124)
  • Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (Thermo Fisher, 10010023)
  • TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) (Fisher scientific, 10224683)
  • (Optional) TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)
  • Inoculation loop or disposable tweezers
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Q32850)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Agilent Genomic DNA 165 kb Analysis Kit (Agilent, FP-1002-0275)
Instrumental
  • Dispositivo PromethION 24/48
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Incubator or water bath set at 37°C and 50°C
  • Centrifuge and rotor suitable for 15 ml Falcon tubes
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Wide-bore pipette tips
  • P1000 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Agilent Femto Pulse System (or equivalent for read length QC)
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

The above list of materials, consumables, and equipment is for the extraction method in the sample preparation section, as well as the library preparation section of the protocol. If you have pre-extracted sample(s), you will only require the materials for the library preparation section of this protocol.

For the library preparation protocol, you will need 3 µg of genomic DNA with an N50 of 10 kb.

For this end-to-end workflow, we recommend extracting high molecular weight human gDNA from from 5 x 10⁶ cells (e.g. cell culture or tissue sample) using the QIAGEN Puregene Cell Kit in the Sample Preparation step.

Other extraction protocols are available but have not been tested by Oxford Nanopore Technologies.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Eppendorf tube orientation in centrifuge

For all centrifugation steps, ensure that tubes are loaded into the centrifuge with the hinge side of the tube facing outwards. This will assist in visual identification of the pellet.

Ensure gentle handling when removing the tubes from the centrifuge to avoid dislodging the pellet.

Eppendorf tube hinge into centrifuge image

CONSEJO

Recomendamos utilizar el módulo de acompañamiento Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L) de NEBNext®, que contiene los reactivos necesarios para utilizar junto al Ligation Sequencing Kit.

La versión anterior, NEBNext® Companion Module para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S o E7180L) también es compatible, pero el modelo recomendado v2, ofrece una ligadura y adición de dA más eficaces.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000
IMPORTANTE

A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador Ligation Adapter (LA), recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB) incluido en el kit Ligation Sequencing Kit V14, en lugar del tampón de ligasa de otros fabricantes.

IMPORTANTE

El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.

Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.

Formato de tubos monouso SQK-LSK114 v2 ES

Formato en botella SQK-LSK114 v3 ES

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.

Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.

3. Human cell line DNA extraction using the QIAGEN Puregene Cell Kit

Material
  • 5 x 10⁶ cells (e.g. cell culture or tissue sample)
Consumibles
  • Puregene Cell Kit (QIAGEN, 158043)
  • Freshly prepared cold 70% ethanol in nuclease-free water
  • TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) (Fisher scientific, 10224683)
  • Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (Thermo Fisher, 10010023)
  • Isopropanol, 100% (Fisher, 10723124)
  • 15 ml Falcon tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Inoculation loop or disposable tweezers
  • Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Q32850)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Incubator or water bath set at 37°C and 50°C
  • Centrifuge and rotor suitable for 15 ml Falcon tubes
  • Vortex mixer
  • Wide-bore pipette tips
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Cubeta con hielo
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Prepare a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube with approximately 1 ml of 70% ethanol and store on ice to cool.

We recommend to harvest and pellet 5 x 10⁶ cells in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. However, this may vary depending on your sample type. If any liquid remains associated with the pellet, spin down the cells again, then aspirate and discard the remaining supernatant.

Add 200 µl of 1x PBS to pelleted cells.

Centrifuge at 300 x g for 3 minutes.

Without disturbing the pellet, aspirate and discard the supernatant.

Add 3 ml of Cell Lysis Solution, and pipet up and down gently to lyse the cells and homogenise the solution until no clumps remain.

Ensure that the solution is homogenous.

Transfer the resuspended cells to a 15 ml Falcon. If clumps of cells remain, gently invert the tube to ensure resuspension.

Incubate the sample at 37°C for 30 minutes.

Add 1000 µl of the Protein Precipitation Solution to the lysed cells and mix by vortexing for three pulses of 5 seconds.

Centrifuge the sample at 2000 x g for 5 minutes.

The precipitated protein should form a tight, reddish-brown pellet.

If the protein pellet is not tight, incubate on ice for 5 minutes and repeat the centrifugation.

Add 3 ml of isopropanol into a clean 15 ml falcon tube.

Mix by gently inverting the tube 50 times until the DNA is visible as threads or a clump.

Spool the DNA using an inoculation loop or disposable tweezers.

Briefly dip the spooled DNA in the 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube containing cold 80% ethanol and allow to air dry for a few seconds.

Transfer the inoculation loop or tweezers with the spooled DNA to a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube containing 250 µl TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and allow the DNA to gently dislodge from the loop/tweezers.

Incubate the DNA pellet for 2 hours at 50°C, occasionally mixing the tube by gentle inversion to aid dissolving the pellet. Alternatively, the DNA pellet can be left overnight at room temperature.

Note: The pellet may take some time to dissolve. Ensure the solution is homogenous before proceeding to quantification by gentle inversion and spin down.

Quantify the sample three times using the Qubit dsDNA BR Assay Kit, ensuring that replicate Qubit measurements are consistent before continuing to the next step.

If the Qubit measurements are not consistent, this could indicate that the DNA has not been homogeneously resuspended. If this occurs, we recommend increasing the incubation time to aid with resuspension of the DNA pellet.

FIN DEL PROCESO

Take the sample in 250 µl TE buffer forwards into the next step or the sample can be stored at 4°C overnight.

4. Shearing DNA for 10 kb input using the Covaris g-TUBE™

Material
  • 2 µg of extracted high molecular weight gDNA
Consumibles
  • g-TUBE™ (Covaris, 520079)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • (Optional) TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)
  • Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Q32850)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Agilent Genomic DNA 165 kb Analysis Kit (Agilent, FP-1002-0275)
Instrumental
  • Microfuge
  • Pipeta y puntas P200
  • P100 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P20
  • P2 pipette and tips
  • Agilent Femto Pulse System (or equivalent for read length QC)
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
MEDIDA OPCIONAL

We recommend using TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) rather than nuclease-free water if the library is going to be stored over a long-term period.

Transfer 2 μg extracted gDNA into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, and adjust the volume to 100 μl with nuclease-free water.

Mix the DNA thoroughly by flicking the tube. Spin down briefly in a microfuge.

Transfer the genomic DNA sample in 100 μl to a Covaris g-TUBE™.

For a fragment length of 10 kb, centrifuge the g-TUBE™ at 4300 x g for one minute at room temperature. Remove and check that all the DNA has passed through the tube.

Note: Please ensure that you are using the correct speed for your equipment and input sample to achieve shearing of 10 kb fragment lengths.

CONSEJO

If DNA remains in the upper chamber of the Covaris g-TUBE™, spin again for one minute at the same speed.

Invert the g-TUBE™ and centrifuge again for one minute to collect the fragmented DNA. Remove and check that all the DNA has passed through the tube.

CONSEJO

If DNA remains in the upper chamber of the Covaris g-TUBE™, spin again for one minute at the same speed.

Transfer the 100 μl fragmented DNA into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer and check sample read length using the Agilent Femto Pulse System. An N50 of 10 kb read lengths is to be expected.

FIN DEL PROCESO

Take forwards 1 μg sample into the next step or the sample can be stored at 4°C overnight.

5. Reparación del ADN y preparación de los extremos (3)

Material
  • 1 µg of fragmented gDNA
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Mix (M6630), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Buffer v2 (E7363), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix (E7646), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Microcentrífuga
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Preparar los reactivos NEB siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

  1. Descongelar todos los reactivos en hielo.

  2. Golpear suavemente los tubos de los reactivos con el índice o invertirlos, a fin de mezclarlos bien.
    Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Centrifugar los tubos antes de abrirlos.

  4. Mezclar en vórtex los tampones FFPE DNA Repair Buffer v2 o FFPE DNA Repair Buffer y Ultra II End Prep Reaction Buffer, a fin de mezclarlos bien.

    Nota: Es posible que los tampones tengan un precipitado blanco. Si ello ocurre, dejar que la mezcla se ponga a temperatura ambiente y mezclar el tampón con la pipeta varias veces para romper el precipitado; a continuación, mezclar rápido en vórtex.

  5. El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

Preparación del ADN en agua sin nucleasas: (3)

  1. Transferir 1 μg (o 100-200 fmol) de muestra de ADN a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

  2. Ajustar el volumen a un total de 47 μl con agua sin nucleasas.

  3. Mezclar minuciosamente con la pipeta o golpear el tubo suavemente con el índice.

  4. Centrifugar brevemente

En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente: (3)

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
ADN del paso anterior 47 µl
(opcional) DNA Control Sample (DCS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 3,5 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 3,5 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Using a thermal cycler, incubate the reaction at 20°C for 5 minutes, then 65°C for 5 minutes and hold at 4°C.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 600 µl of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta. (1)

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 250 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit. (3)

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente. (2)

6. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
  • Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
  • Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • Elution Buffer (EB) from the Ligation Sequencing Kit
Consumibles
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.

Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.

Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.

Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

Thaw the Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
Muestra de ADN del paso anterior 60 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
NEBNext Quick T4 DNA Ligase 10 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Total 100 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Wash the beads by adding 250 μl Long Fragment Buffer (LFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet for at least 5 minutes. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 33 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C.

Pellet the beads on a magnet for 10 minutes until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 33 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

IMPORTANTE

For libraries with an N50 of 10 kb, we recommend loading at least 200-300 ng (35-50 fmol) of your final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.

This protocol has been optimised for output to achieve the analysis of one genome at 30X coverage.

It is vital to ensure 200-300 ng of 10 kb input is loaded onto the flow cell to maximise pore occupancy from the beginning of the run for optimal sequencing. If pore occupancy is low at the beginning of a run, more terminal blocking will occur throughout sequencing which will result in lower outputs.

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

7. Priming and loading the PromethION Flow Cell

Material
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Library Solution (LIS)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
  • Celda de flujo PromethION
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • PromethION device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P20
IMPORTANTE

This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

To prepare the flow cell priming mix, combine Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF), as directed below. Mix by vortexing at room temperature.

Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format. Please follow the instructions for your kit format.

Single-use tubes format: Add 30 µl Flow Cell Tether (FCT) directly to a tube of Flow Cell Flush (FCF).

Bottle format: In a clean suitable tube for the number of flow cells, combine the following reagents:

Reagent Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Total volume 1,200 µl
IMPORTANTE

Una vez sacadas de la nevera, esperar 20 minutos antes de insertar las celdas de flujo en el dispositivo y así darles tiempo a que estén a temperatura ambiente. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Procure que la almohadilla térmica (color gris oscuro) esté enganchada en la parte posterior.

For PromethION 2 Solo, load the flow cell(s) as follows:

  1. Place the flow cell flat on the metal plate.

  2. Slide the flow cell into the docking port until the gold pins or green board cannot be seen.

J2068 FC-into-P2-animation V5

For the PromethION 24/48, load the flow cell(s) into the docking ports:

  1. Line up the flow cell with the connector horizontally and vertically before smoothly inserting into position.
  2. Press down firmly onto the flow cell and ensure the latch engages and clicks into place.

Step 1a V3

Step 1B

IMPORTANTE

Insertion of the flow cells at the wrong angle can cause damage to the pins on the PromethION and affect your sequencing results. If you find the pins on a PromethION position are damaged, please contact support@nanoporetech.com for assistance.

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

Slide the inlet port cover clockwise to open.

Prom loading 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

After opening the inlet port, draw back a small volume to remove any air bubbles:

  1. Set a P1000 pipette tip to 200 µl.
  2. Insert the tip into the inlet port.
  3. Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you see a small volume of buffer entering the pipette tip.

Step 3 v1

Load 500 µl of the priming mix into the flow cell via the inlet port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait five minutes. During this time, prepare the library for loading using the next steps in the protocol.

Step 4 v1

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) 68 µl
DNA library 32 µl
Total 200 µl

Note: Library loading volume has been increased to improve array coverage.

Complete the flow cell priming by slowly loading 500 µl of the priming mix into the inlet port.

Step 5 v1

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Load 200 µl of library into the inlet port using a P1000 pipette.

Step 6 v1

Close the valve to seal the inlet port.

Step 7 V2

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

If the light shield has been removed from the flow cell, install the light shield as follows:

  1. Align the inlet port cut out of the light shield with the inlet port cover on the flow cell. The leading edge of the light shield should sit above the flow cell ID.
  2. Firmly press the light shield around the inlet port cover. The inlet port clip will click into place underneath the inlet port cover.

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

FIN DEL PROCESO

Close the PromethION lid when ready to start a sequencing run on MinKNOW.

Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.

8. Data acquisition and basecalling

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software.

We recommend basecalling with the high accuracy (HAC) basecaller in real-time with BAM selected as output type using the P2 Solo or P24/P48 device.

You must generate a BAM file from your sequening run, as this is required for input into the wf-human-variation workflow.

Refer to the links below containing the detailed instructions for setting up the device and sequencing run:

Below are the recommended sequencing parameters for MinKNOW.

MinKNOW settings for 10kb human sample on PromethION

We recommend using the modified bases option for basecalling and ensuring a BAM output is selected when setting up your MinKNOW run. The remaining sequencing parameters are kept to default. Below are our current recommendations:

Positions

Flow cell position: [user defined]

Experiment name: [user defined]

Flow cell type: FLO-PRO114M

Sample ID: [user defined]

Kit

Kit selection: Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114)

Run configuration

Sequencing and analysis

Basecalling: On [default] Modified bases: On with '5mC & 5hmC CG contexts' selected Model: High-accuracy basecalling (HAC) [default]

Barcoding: Disabled [default]

Alignment: Off [default]
We do not currently recommend live alignment during sequencing, as it can slow down system processing.

Adaptive sampling: Off [default]

Advanced options Active channel selection: On [default] Time between pore scans: 1.5 [default] Reserve pores: On [default]

Data targets

Run limit: 72 hours [default]

Output

Output format .POD5: On [default] .FASTQ: On [default] .BAM: On

Filtering: On [default] Qscore: 9 [default] Minimum read length: 200 bp [default]

IMPORTANTE

We do not recommend live alignment during sequencing, as it can slow down system processing.

You can align your BAM file post-sequencing by following one of the methods below:

Aligning the BAM file in MinKNOW Aligning the BAM file during the wf-human-variation workflow
Align the BAM output after live basecalling in MinKNOW. This will prevent slowing down your sytems processing.

The aligned BAM file can be used as your file input in the wf-human-variation workflow.

Using mapped BAM as input, the workflow will take 1-2 hours.		 You can provide a reference genome along with the unaligned BAM file during the wf-human-variation workflow set-up.

Using an unmapped BAM is used as input, the workflow will take approximately 5-8 hours.

Further information is available in the Downstream analysis section of this protocol.

9. Downstream analysis

Analysis of human cell DNA sequence data

For the analysis of human cell DNA sequence data, we recommend the wf-human-variation workflow. This end-to-end software pipeline is implemented using the Nextflow workflow language and implements methods for the calling of single nucleotide polymorphisms (SNPs), structural variants (SVs), and for reporting DNA methylation information.

The wf-human-variation workflow is best run from the BAM file produced by MinKNOW when the modified base model for basecalling is selected. If sequence read mapping to the reference genome is not performed by MinKNOW, we recommend to perform the basecalling using the wf-basecalling workflow. Ensure you save the outputs in BAM format by providing the --output_bam option.

The tools below are used in the analysis workflow and can be run in isolation or together:

  1. Sniffles2 calls SVs and file output include an HTML report of QC metrics and VCF format list of variants and their quality scores.

  2. Clair3 calls SNPs and file output includes an HTML report of QC metrics and VCF format list of variants and their quality scores.

  3. modkit extracts methylation information from the provided BAM file which is summarised in a BEDmethyl format file.

The wf-human-variation workflow is preconfigured using appropriate parameters and requires tuning only for the choice of reference genome and Clair3 model. Please see the project’s documentation for further details.

The results from the wf-human-variation workflow can be further explored by viewing in a track-based genome browser such as IGV can be assessed for known pathogenicity through tertiary analysis software.

EPI2ME analysis workflow

The wf-human-variation workflow is intended to be run using the Nextflow software.

We recommend performing downstream analysis using EPI2ME which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a Graphical User Interfaces (GUI). EPI2ME maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis. The collection of all our available EPI2ME workflows can be found here.

For new users, the quick start guide can be found here outlining how to use this interface.

IMPORTANTE

Compute requirements for the wf-human-variation workflow on EPI2ME

Recommended requirements Minimum requirements
CPUs = 32 CPUs = 16
Memory = 128GB Memory = 32GB

Approximate run time: Variable depending on whether it is targeted sequencing or whole genome sequencing, as well as coverage and the individual analyses requested. For instance, a 90X human sample run (options: --snp --sv --mod --str --cnv --phased --sex male) takes less than 8h with recommended resources.

ARM processor support: False

MEDIDA OPCIONAL

The wf-human-variation workflow can also be run using the command line interface (CLI)

Please see the Github page for further details.

Note: We only recommend the command line interface (CLI) for experienced users.

Open the EPI2ME app using the desktop shortcut.

On the landing page, open the workflow tab on the left-hand sidebar.

1 landing page EPI2ME

Navigate to the Available workflows tab and click on wf-human-variation option.

2 wf human var

Click install.

3 install human var

Navigate to the Installed tab and click on the installed wf-human-variation workflow.

4 wf human var select

MEDIDA OPCIONAL

If the workflow was already installed, check for updates by clicking 'Update workflow'.

We recommend running the latest version of our workflows for the best results.

5 wf human var update

Click on Run this workflow to open the launch wizard.

6 human var run

Select the environment you are running the workflow from:

7 human var run II

Click on the sub-workflow(s) you want to run in the wf-human-variation analysis.

8 wf human var subworkflows

You must have at least one of the sub-workflows selected to proceed with analysis.

9 wf human var subworkflows selected

Note: For more information on the sub-workflows click on the "Expand" option in the platform, or visit our online EPI2ME documentation.

Navigate to the 'Main options' tab to assign a 'Sample name' as an identifier in workflow outputs.

10 wf human var sample name

IMPORTANTE

The wf-human-variation workflow uses sequencing data in the form of a single BAM file or a folder of BAM files.

The BAM files used as an input can be aligned or unaligned:

Aligning the BAM file in MinKNOW (prior to the wf-human-variation workflow) Aligning the BAM file during the wf-human-variation workflow (during the wf-human-variation workflow)
Align the BAM output after live basecalling in MinKNOW. This will prevent slowing down your sytems processing.

The aligned BAM file can be used as your file input in the wf-human-variation workflow.

For more information on post-run alignment in MinKNOW please visit our MinKNOW protocol.

Using mapped BAM as input, the workflow will take 1-2 hours.		 You can provide a reference genome along with the unaligned BAM file during the wf-human-variation workflow set-up.

Using an unmapped BAM is used as input, the workflow will take approximately 5-8 hours.

In the 'Main options' upload your sequencing data in the form of a single BAM file or a folder of BAM files.

11 wf human var BAM input

MEDIDA OPCIONAL

If you have an unaligned BAM file as input, in the 'Main options' upload your reference genome in FASTA format.

12 wf human var reference FASTA

Click Launch workflow.

Ensure all parameter options have green ticks.

13 wf human var launch

Once the wf-human-variation workflow finishes, a report will be produced alongside output files.

14 wf human var outputs

wf-human-variation workflow outputs

The primary workflow outputs include:

  • gzipped VCF file containing the SNPs in the dataset from --snp
  • gzipped VCF file containing the SVs in the dataset from --sv
  • gzipped bedMethyl file aggregating modified base counts from --mod
  • HTML report detailing the primary findings of the workflow for QC metrics, and SNP and SV calling
  • If an unaligned BAM file was provided, the workflow will ouput a CRAM file containing the alignments used to make the downstream variant calls.

The secondary workflow outputs:

  • mosdepth ouputs include:
    • {sample_name}.mosdepth.global.dist.txt: a cumulative distribution indicating the proportion of total bases for each and all reference sequences
    • {sample_name}.regions.bed.gz: the mean coverage for each region in the provided BED file
    • {sample_name}.thresholds.bed.gz: the number of bases in each region that are covered at or above each threshold value (1, 10, 20, 30X)

  • bamstats ouputs include:
    • {sample_name}.readstats.tsv.gz: a gzipped TSV summarising per-alignment statistics produced by bamstats
    • {sample_name}.ftagstat.tsv: a text file with summary alignment statistics for each reference sequence

wf-human-variation workflow tips

It is possible to phase SNPs, SVs and modified bases by providing the --phased option.

To improve the accuracy of SV calling, specify a suitable tandem repeat BED for your reference with --tr_bed.

Aggregation of methylation calls with --mod requires data to be basecalled with a model that includes base modifications, providing the MM and ML BAM tags. To do so on MinKNOW, ensure 'Modified bases' option is selected during basecalling set up, with the '5mC' model selected.

Ensure to retain the input reference when basecalling or alignment is performed as CRAM files cannot be read without the corresponding input reference.

For a full list of available basecalling models, refer to the Dorado documentation.

10. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

11. Issues during DNA extraction and library preparation

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Low sample quality

Observation Possible cause Comments and actions
Low DNA purity (Nanodrop reading for DNA OD 260/280 is <1.8 and OD 260/230 is <2.0–2.2) The DNA extraction method does not provide the required purity The effects of contaminants are shown in the Contaminants Know-how piece. Please try an alternative extraction method that does not result in contaminant carryover.

Consider performing an additional AMPure bead clean-up step.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

12. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell For the human genome sequencing protocols, 200-300 ng of good quality library should be loaded on to an R10.4.1 flow cell to keep pore occupancy high.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the SQK-LSK114 kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos (1)

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 8/23/2024

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