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遗传性肿瘤相关基因检测（HCP） (HCP_9227_v114_revB_15Oct2025)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

遗传性肿瘤相关基因检测（HCP） V HCP_9227_v114_revB_15Oct2025

本指南概述了从样本提取、文库制备到测序与数据分析的完整端到端流程。

本实验指南:

  • 使用从全血中提取的基因组 DNA
  • 无需 PCR 扩增
  • 与 R10.4.1 测序芯片兼容

仅供研究使用

FOR RESEARCH USE ONLY.

概览

本指南概述了从样本提取、文库制备到测序与数据分析的完整端到端流程。

本实验指南:

  • 使用从全血中提取的基因组 DNA
  • 无需 PCR 扩增
  • 与 R10.4.1 测序芯片兼容

仅供研究使用

Document version: HCP_9227_v114_revB_15Oct2025

1. 实验方案概览

遗传性肿瘤相关基因检测（HCP）实验指南简介

本指南介绍了遗传性肿瘤相关基因检测（HCP）的 DNA 提取、文库制备及数据分析流程。该流程采用免扩增条形码试剂盒，并利用 MinKNOW 的适应性采样功能进行目标区域富集，每张 PromethION 测序芯片支持 3 个样本的混样测序。遗传性肿瘤检测方案包包含本指南所需的全部 Oxford Nanopore Technologies 试剂，提供 18 个样本（HCP18）和 72 个样本（HCP72）两种规格，内含免扩增条形码试剂盒及测序所需的配套产品，是实施本工作流程的标准配置。

请注意，DNA 提取完成后，如需同时处理多个样本，应按每 3 个样本一组进行文库制备。

工作流程步骤概览

实验准备

您将需要：

  • 提取起始样本（全血，DNA）。
  • 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
  • 下载数据收集和分析软件。
  • 检查您的测序芯片上有足够的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

样本制备、建库及测序

实验步骤 流程 时间 中止节点
样本制备 从样本中提取 gDNA 并定量。将 gDNA 片段化并定量。

评估提取产物的长度、浓度和纯度。我们建议您在实验过程中进行各项质量评估，以确保实验顺利完成。		 4 到 6 小时 此时，可将提取的 gDNA 或片段化后的 gDNA 于 –20°C 保存，以备后续使用。
DNA 损伤及末端修复 修复 DNA，并对 DNA 进行末端修复以便与接头连接 60 分钟 4°C 过夜
连接免扩增条形码 将免扩增条形码连接至 DNA 末端。 70 分钟 4°C 过夜
连接测序接头 将测序接头连接到 DNA 末端。 60 分钟 若为短期保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），建议4℃保存；
若为长期储存，建议-80℃保存。
测序芯片的预处理及上样 对测序芯片进行预处理，然后将制备好的 DNA 文库加入测序芯片。 10 分钟
测序 在测序设备上对文库进行测序。 72 小时
数据分析 使用 HCP 数据包进行分析。 120 分钟

Chinese_hereditary_cancer_profiling_nbd114_workflow_pp_II

实验方案适用性

本实验方案只适用于与以下产品搭配使用：

2. 开始前准备：数据包和工作流程设置

数据包和工作流程设置

完成 HCP 注册后，您将通过电子邮件收到数据包下载链接。该数据包包含本产品测序和数据分析所需的全部文件，并已针对本产品完成配置，确保各文件能够正确配合使用。有关在 EPI2ME 中安装 2ME 文件（包括使用演示数据进行测试）的方法，请参阅本指南的数据分析一节。


数据包包含以下内容：

  • 用于 MinKNOW 的遗传性肿瘤适应性采样文件，包括参考基因组 FASTA 文件和目标区域 BED 文件，指导测序过程中目标区域的富集；

  • EPI2ME（2ME）遗传性肿瘤检测分析流程文件，可用于测序后的生物信息学分析。

  • 示例文件

如您已购买遗传性肿瘤检测方案包，但尚未收到来自 Oxford Nanopore CloudHub 平台的电子邮件（其中包含所需数据包的安全链接），请联系我们的技术支持团队 (support@nanoporetech.com) ，并提供您的订单号。我们将协助您获取访问权限。

3. 仪器及耗材

材料
  • （用于提取）人全血：≥ 1 ml（使用 EDTA K2 真空采血管采集）
  • （用于文库制备）约 1 µg 经片段化处理的 gDNA
  • 遗传性肿瘤检测方案包（HCP18 或 HCP72），包括：
  • 免扩增条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）
  • 长片段缓冲液扩展包（EXP-LFB001）
  • 适用于 72 样本方案包的短片段缓冲液扩展包（EXP-SFB001）
  • PromethION 测序芯片
耗材
  • Puregene Blood Kit（QIAGEN，158023）
  • g-TUBE™（Covaris，520079）
  • NEBNext FFPE修复混合液（NEB，M6630）
  • NEBNext Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
  • NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
  • NEBNext®快速连接模块（NEB，E6056）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
  • 异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
  • TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）（Fisher scientific，10224683）
  • Qubit dsDNA BR Assay（双链DNA宽范围检测）试剂盒（Invitrogen，Q32850）
  • Agilent 基因组 DNA 165 kb 分析试剂盒（Agilent，FP-1002-0275）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • 15 ml Falcon离心管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
仪器
  • PromethION 测序设备
  • PromethION 测序芯片遮光片
  • 低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）
  • 适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
  • 恒温加热仪
  • 设定为 37°C 和 50°C 的培养箱或水浴锅
  • 迷你离心机
  • 涡旋混匀仪
  • 热循环仪
  • 适用于 15 ml Falcon 管的离心机及转子
  • Megaruptor 3（Diagenode，B06010003）
  • 宽口移液枪头
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）

Oxford Nanopore Technologies 遗传性肿瘤检测方案包

遗传性肿瘤检测方案包包含本指南所需的全部 Oxford Nanopore Technologies 试剂，提供 18 个样本（HCP18）和 72 个样本（HCP72）两种规格，

方案包内含免扩增条形码试剂盒及测序所需的配套产品，是实施本工作流程的标准配置。

有关遗传性肿瘤检测方案包及其中产品的详细信息，请参阅 Nanopore 商城中的以下产品页面：

上述材料、耗材和设备清单涵盖本指南中样本制备阶段的 DNA 提取流程及后续的文库构建流程。若使用已完成 DNA 提取的样本，则仅需准备文库构建流程所需的材料。

本方案需要以下材料：

核酸提取前，每个样本需备好：

  • 人全血：≥ 1 ml（使用 EDTA K2 真空采血管采集）

文库制备前，每个样本需备好：

  • 约 1 µg 经片段化的 gDNA

起始 DNA

DNA 质控

选择符合质量和浓度要求的起始 DNA 至关重要。使用过少或过多的 DNA，或者质量较差的 DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物）都会影响文库制备。

有关如何对 DNA 样品进行质控，请参考起始 DNA/RNA 质控实验指南。

化学污染物

不同的 DNA 提取方法可能导致纯化后的 DNA 中残留不同的化学污染物。这会影响文库的制备效率和测序质量。请参阅牛津纳米孔社区的污染物 页面了解更多信息。

Eppendorf 离心管的放置方向

在所有离心步骤中，请将离心管盖与管体的连接处朝外放置，以便快速定位沉淀。

取出离心管时应轻拿轻放，避免扰动沉淀。

Chinese Metagenomics Eppendorf Hinge

第三方试剂

Oxford Nanopore Technologies 推荐您使用本实验指南中列出的所有第三方试剂，并已对其进行验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

除非指南中另有说明，所有第三方试剂均建议按照制造商的说明进行使用前准备。

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到 PromethION 测序芯片12周内进行。Oxford Nanopore Technologies 会对活性孔数量少于以下标准、且尚未投入测序的芯片进行替换*：请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
PromethION 测序芯片 5000

*（请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于 Oxford Nanopore Technologies 推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两日内递交给我们。）

本试剂盒及实验指南中所使用的免扩增接头（NA） 不能与其它测序接头互换使用。

4. 从 1 ml 人全血中纯化 gDNA

材料
  • ≥ 1 mL 人全血（使用 EDTA K2 真空采血管采集）
耗材
  • Puregene Blood Kit（QIAGEN，158023）
  • 吸水材料（如吸水纸或纸巾）
  • 新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
  • TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）（Fisher scientific，10224683）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • Qubit dsDNA BR Assay（双链DNA宽范围检测）试剂盒（Invitrogen，Q32850）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • 15 ml Falcon离心管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • 适用于 15 ml Falcon 管的离心机及转子
  • 设定为 37°C 和 50°C 的培养箱或水浴锅
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • 宽口移液枪头
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
可选仪器
  • Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）

准备血液样本。

  • 如您使用新鲜血液或 4°C 保存的血液，请直接进行 DNA 提取；
  • 如使用冷冻血液，请先将样本完全解冻，再进行 DNA 提取。

向 15 ml 离心管中加入 3 ml 红细胞裂解液（RBC Lysis Solution）。

充分混匀 EDTA K2 采血管中的血液，然后取 1 ml 血液样本加入含有红细胞裂解液的离心管中。

将离心管上下颠倒混匀 10 次。

室温（15–25°C）下孵育5分钟。孵育期间，至少将离心管颠倒混匀 1 次。

以 2000 x g 离心两分钟以沉淀白细胞。

小心吸除上清液，确保管内留有白细胞沉淀及约 200 µL 液体。

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。

轻弹离心管，并/或用宽口吸头轻轻吹打，将白细胞沉淀重悬于残留液体中。

注意： 细胞沉淀在重悬后应完全分散，以利于后续的细胞裂解步骤。

加入 3 ml 细胞裂解液（Cell Lysis Solution）。

注意： 轻柔吹打 10–15 次，使细胞充分裂解，直至样品完全均一、无结块。确保溶液混合均匀。

37℃ 下孵育 30 分钟。

注意： 孵育结束时，请确保溶液充分均一，且无结块残留。
您可按需使用宽口移液枪头吹打混匀，或轻柔倒转离心管以促进溶液混匀。

加入 15 μl RNase A 溶液，在 37°C 孵育 15 分钟。

将反应管转移至冰浴中，冷却 3 分钟，使使样本迅速降温。

向样本中加入 1 ml 蛋白沉淀液（Protein Precipitation Solution）。将离心管涡旋振荡两次，每次 5 秒。

2000 × g 离心 5 分钟。

注意： 蛋白应形成紧实的红褐色沉淀。若蛋白沉淀不够紧实，可将离心管在冰上放置 5 分钟后重复离心。

在一支新的 15 ml Falcon 管中加入 3 ml 异丙醇。

将样品管中的上清液小心倒入装有异丙醇的 15 ml Falcon 管中。

倾倒过程中应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

或者，您也可使用移液枪转移上清液，操作过程中同样应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

注意： 如蛋白沉淀在任何步骤中被扰动，请重新以 2000 × g 离心 10 分钟。请确保仅转移澄清的上清液，防止蛋白污染最终洗脱液。

轻柔倒转离心管约 50 次混匀，直至 DNA 呈丝状或结块。

2000 × g 离心 3 分钟。

注意： DNA 可能在管底形成小的白色沉淀。

小心弃去上清液，并将离心管倒置在干净的吸水纸上以沥干残液。确保 DNA 沉淀未被扰动且留在管内。

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。

准备 300μl 新制备的 80％ 乙醇（用无核酸酶水配制），置于冰上。

向样品中加入 300 μl 预冷、新鲜配制的 80% 乙醇，轻轻倒转数次以清洗 DNA 沉淀。

将 DNA 沉淀及全部 300 μl 乙醇转移至一支新的 1.5 ml Eppendorf 离心管中。

2000 × g 离心 1 分钟。

小心弃去上清液，并将离心管倒置在干净的吸水纸上以沥干残液。确保 DNA 沉淀未被扰动且留在管内。

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。

打开管盖，将 DNA 沉淀在空气中干燥 1 分钟。

注意： 请避免过度干燥，DNA 沉淀不应干燥至开裂。

向 DNA 沉淀中加入 100 μl TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）。轻弹离心管以重悬沉淀。

在 50°C 下孵育 2 小时，期间使用宽口枪头不时混匀全部体积（100 μl）。

注意： DNA 沉淀可能需要一定时间才能完全溶解；定量前请确保溶液已充分混匀。

可选： 孵育步骤亦可在室温下过夜完成。

使用 Qubit dsDNA BR Assay（双链 DNA 宽范围检测）试剂盒对样品进行三次定量。 在继续后续步骤前，请确认三次测量结果一致。

注意： 核酸提取后，通常可获得 10–30 µg 的 gDNA。
预期 Qubit 测定浓度约为 100–300 ng/μl。

如果 Qubit 测量结果存在较大差异，可能是由于 DNA 未充分重悬混匀所致。

此时建议延长孵育时间，以促进 DNA 完全溶解。

注意： 将样品置于恒温混匀仪内，在 50°C 条件下以 300 rpm 轻柔振荡孵育，可促进洗脱，或使用翻转式混匀仪。

您可使用 Femto-Pulse（Agilent）评估所提取 gDNA 的长度和质量。

gDNA extract frag analyser human blood variant e2e

使用 Puregene Blood Kit 提取的人全血 gDNA 片段长度分布示例。

提取出的 gDNA 即可用于后续的 gDNA 片段大小筛选步骤，或在 4°C 条件下保存过夜。

5. 使用 Covaris g-TUBE 管打断 gDNA

材料
  • > 1 µg 上一步提取的 gDNA
耗材
  • g-TUBE (Covaris, 520079)
  • 无核酸酶水（如 ThermoFisher，AM9937）
  • Qubit dsDNA BR Assay（双链DNA宽范围检测）试剂盒（Invitrogen，Q32850）
  • Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）
  • 迷你离心机
  • Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • 宽口移液枪头
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头

使用无核酸酶水配制 DNA：

1.请确保已备好从样本中提取的 1 µg gDNA，并将其转移至 1.5 ml Eppendorf 管中。

2.如不足50 μl，请加入无核酸酶水补足。

3.使用宽口枪头充分吹打混匀。

4.使用迷你离心机瞬时离心。

将 50 µl 样品加入 g-TUBE 上端，旋紧管盖。

将样本管放入离心机，并按照制造商说明书的要求对离心机进行正确配平。

按以下条件对样本进行离心：

注意：离心转速可能因离心机型号而异。有关设备的详细信息，请参阅制造商的使用说明书。

1.以 6,000 rpm（3381 RCF） 离心 60 秒。

2.目视检查，确认样品已完全从 g-TUBE 上腔流入下腔。如果样品尚未完全通过，请重复上述离心步骤，直至样品全部流入下腔。

3.将 g-TUBE 从离心机中取出，倒置后重新放回离心机，确认样品位于倒置后的上腔。

4.按上述离心条件，再次对 g-TUBE 进行离心：6,000 rpm（3381 RCF） 离心 60 秒。

5.目视检查，确认样品已完全从 g-TUBE 上腔流入下腔。如果样品尚未完全通过，请重复上述离心步骤，直至样品全部流入下腔。

再重复前一步骤两次，使样本在正、反两个方向通过 g-TUBE 的次数均达到 3 次。

待样品全部流入下腔后，旋下 g-TUBE 管身，保留装有样品的旋盖部分。

从旋盖中吸出样品，转移至洁净的 1.5 ml Eppendorf 离心管中。

使用 Qubit dsDNA BR Assay（双链 DNA 宽范围检测）试剂盒对样品进行定量。

请注意： g-TUBE 剪切后的 gDNA 量预计约为 1 µg 。预期 Qubit 测定浓度约为 18–20 ng/μl。

您可使用 Femto-Pulse（Agilent）评估打断后的 gDNA 长度。

剪切后的预期片段长度约为 7.5–8.5 kb。

所得 48 µL 打断后的 gDNA 可直接用于后续文库制备，或于 4°C 保存过夜。

6. DNA损伤及末端修复

材料
  • 每个样本：上一步获得的 48 µL （1 µg）片段化 gDNA
耗材
  • NEBNext FFPE DNA 修复混合液（NEB，M6630）
  • NEBNext® Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
  • 多通道移液枪和枪头
  • 涡旋混匀仪
  • 热循环仪
  • 迷你离心机
  • 盛有冰的冰桶
  • 低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）

根据生产厂家的说明准备NEBNext FFPE DNA 修复混合液和 NEBNext Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块，并置于冰上。

为获得最优表现，NEB建议如下：

  1. 于冰上解冻所有试剂。

  2. 轻弹并/或翻转各管，确保各试剂充分混匀。
    注意： 切勿涡旋振荡 FFPE DNA修复混合液或 Ultra II末端修复酶混合物。

  3. 同一日内首次打开一管试剂前，请务必先将该管试剂瞬时离心。

  4. Ultra II 末端修复缓冲液和 FFPE DNA 修复缓冲液内可能出现少量沉淀。待此两管液体回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后涡旋振荡30秒，以确保沉淀充分溶解。
    注意： 请务必涡旋振荡混匀缓冲液。

  5. FFPE DNA 修复缓冲液可能轻微泛黄，不影响使用。

请勿涡旋振荡 NEBNext FFPE DNA 修复混合液或 NEBNext Ultra II 末端修复酶混合物。

请务必涡旋振荡 NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液及 NEBNext Ultra II 末端修复反应缓冲液，以充分混匀。

查看是否有残留沉淀。涡旋振荡至少 30 秒以溶解所有沉淀。

准备 DNA 样本：

1.确保每个样本均为 48 µl（约含 1 µg DNA），并分别置于洁净、独立的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。

2.吹打或轻弹离心管，充分混匀。使用迷你离心机瞬时离心。

在各 PCR 管中，混合以下试剂：

试剂 体积
DNA 样本 48 µl
NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液 3.5 µl
Ultra II 末端修复反应缓冲液 3.5 µl
Ultra II 末端修复酶混合物 3 µl
NEBNext FFPE DNA 修复混合液 2 µl
总体积 60 µl

充分吹打混匀管中试剂，再瞬时离心。

使用配备热盖的热循环仪，在 20°C 下孵育 5 分钟，再于 65°C 下孵育 5 分钟，随后在 4°C 保持。

将反应管从 PCR 仪中取出，并立即置于冰上。

此时，您可将每个样本的反应体系分别转移至一支洁净的 1.5 ml Eppendorf LoBind 管中，以便后续操作。

涡旋振荡以重悬 AMPure XP 磁珠（AXP）。

向每个末端修复反应中加入 1 倍体积（60 µL）重悬后的 AMPure XP 磁珠（AXP），轻弹离心管混匀。

将离心管置于低速旋转式混匀仪（如Hula混匀仪）上室温孵育10分钟。

用无核酸酶水新鲜配制 2 ml 80% 乙醇（足够 3 个样本使用）。

请注意：请确保配制足量的 80% 乙醇，以满足所有样本的处理需求。

将各样品瞬时离心，并于磁力架上静置 10 分钟，待磁珠与液相分离，且液相澄清无色。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

保持离心管在磁力架上不动，以 200 µl 新鲜制备的 80% 乙醇洗涤磁珠。小心不要扰动磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

将装有样本的各离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于20 µl 无核酸酶水中。室温下孵育5分钟。

将离心管静置于磁力架上至少 1 分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将每个样本的 20 μl 洗脱产物分别转移至一支新的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

请注意：由于样本尚未添加条形码，请务必单独处理各样本。

取1ul洗脱样品，用Qubit定量。

我们建议分别对这 3 个样本各进行 3 次 Qubit 测定，以获得更准确的定量结果，便于后续在添加条形码前将各样本调整至相同浓度。

请注意： 末端修复后，每个样本的预计回收量为 500–700 ng。

根据定量结果，以产量最低的样本为基准，对所有样本进行调整，具体步骤如下：

1.取16 µl 产量最低的样本，转移至一支新的 0.2ml 薄壁 PCR 管中。

2.从其余各样本中分别取出与产量最低样本等质量的 DNA，分别加入洁净的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。

3.使用无核酸酶水将每个样本的体积补足至 16 μL。

完成末端修复的样本即可用于稍后的免扩增条形码连接步骤。

可选：此时，您也可以将样本置于 4℃ 保存过夜。

7. 免扩增条形码连接

材料
  • 免扩增条形码（NB01-24）
  • AMPure XP 磁珠（AXP）
  • EDTA（EDTA）
  • 短片段缓冲液（SFB）
耗材
  • NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Eppendorf 低吸附 twin.tec® 96 孔 PCR 板，半裙边（Merck，EP0030129504）带热封
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • Qubit™ dsDNA HS Assay（双链 DNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
仪器
  • 磁力架
  • 涡旋混匀仪
  • 低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）
  • 迷你离心机
  • 热循环仪
  • 盛有冰的冰桶
  • 多通道移液枪和枪头
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）

根据生产厂家的说明准备NEB Blunt/TA 连接酶预混液及NEBNext快速连接模块，并置于冰上：

  • 于室温下解冻试剂；
  • 瞬时离心各试剂管5秒；
  • 上下吹打整管试剂10次，以确保充分混匀。

于室温下解冻AMPure XP磁珠（AXP），并涡旋振荡混匀，置于室温。

于室温下解冻EDTA，并涡旋振荡混匀，然后瞬时离心，置于冰上。

于室温下解冻短片段缓冲液（SFB），并涡旋振荡混匀，然后置于冰上。

根据样本数目，于室温下解冻相应数目的免扩增条形码（NB01-24）。分别吹打混匀，瞬时离心后置于冰上。

条形码板孔仅限单次使用。使用前请确认所选孔密封完好；一旦刺穿或开启，不得再次使用。

为计划上样于同一张 PromethION 测序芯片的各样本选择不同的条形码。每张 PromethION 测序芯片最多支持 3 个经条形码标记的样本混样测序。

请注意： 每个样本使用一种条形码。

向各样本所在的 0.2ml 薄壁 PCR 管中，按下表顺序加入各试剂。每添加一样试剂后，请吹打混匀，再添加下一样：

试剂 体积
经过末端修复的DNA 16 µl
免扩增条形码 (NB01-24) 4 µl
Blunt/TA 连接酶预混液 20 µl
总体积 40 µl

轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。

室温下孵育20分钟。

向每管样本中加入 4 µl EDTA，吹打混匀，然后瞬时离心。

在此步骤中添加EDTA的目的是终止反应。

于一支洁净的 1.5 mL Eppendorf DNA LoBind 离心管中，合并已连接条形码的各 DNA 样品（每组最多三个）。

涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。

向混合后的反应体系中加入 0.65× 体积（88 µL）的 AMPure XP 磁珠（AXP），吹打混匀。

将离心管置于低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）上室温孵育10分钟。

下一步纯化过程中，请使用短片段缓冲液（SFB）而非 80% 乙醇洗涤磁珠。

使用 80% 乙醇可能会导致实验结果欠佳。

将样品瞬时离心，再静置于磁力架上5分钟待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，直到洗脱液澄清无色，吸出上清。

加入 500 µL 短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管，重悬磁珠；瞬时离心后，将样品重新置于磁力架上，直至磁珠完全吸附、液相澄清。随后用移液枪吸出缓冲液并弃去。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的缓冲液。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于 32 µl 的无核酸酶水中，轻弹离心管混匀。

37℃ 下孵育 10 分钟。请每两分钟轻弹离心管 10 秒以搅动样本，促进 DNA 洗脱。

将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将此 32 µl 洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。

请注意： 添加免扩增条形码后，每个样本的预计回收量为 600–800 ng。

连有条形码的DNA样本将用于稍后的接头连接及纯化步骤。如需要，您也可以此时将样品置于4℃储存过夜。

8. 接头连接及纯化

材料
  • 长片段缓冲液（LFB）
  • 洗脱缓冲液（EB）
  • 免扩增接头（NA）
  • AMPure XP 磁珠（AXP）
耗材
  • NEBNext®快速连接模块（NEB，E6056）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • Qubit™ dsDNA HS Assay（双链 DNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
仪器
  • 迷你离心机
  • 磁力架
  • 涡旋混匀仪
  • 低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）
  • 热循环仪
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • 盛有冰的冰桶
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）

本试剂盒及实验指南中所使用的免扩增接头（NA） 不能与其它测序接头互换使用。

测序芯片质检

我们强烈建议在开始文库制备之前，对测序芯片的活性纳米孔数量进行质检，以确保其足够支持实验的顺利进行。

详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的 测序芯片质检说明。

根据生产厂家的说明准备NEBNext 快速连接反应模块，并置于冰上：

1.于室温下解冻试剂；

2.瞬时离心各试剂管5秒；

3.每次吸取全部反应液进行吹打混匀，共 10 次，确保试剂充分混匀。 注意： 请勿涡旋振荡快速 T4 DNA 连接酶。

NEBNext快速连接反应缓冲液（5x）内可能存在少量沉淀。请待该缓冲液回复至室温后，吹打数次打散沉淀，再涡旋振荡数秒以充分混匀。

请勿涡旋振荡快速T4 DNA连接酶。

将免扩增接头（NA）和 T4 DNA 连接酶瞬时离心后吹打混匀，然后置于冰上。

将洗脱缓冲液（EB）于室温下解冻，涡旋振荡混匀后，再瞬时离心，置于冰上。

在室温下解冻长片段缓冲液（LFB），涡旋振荡混合后，置于冰上。

在一支 1.5ml Eppendorf LoBind 离心管内，将所有试剂按以下顺序混合：

试剂 体积
三样品混合后的带条码文库 30 µl
免扩增接头（NA） 5 µl
NEBNext 快速连接反应缓冲液（5X） 10 µl
快速 T4 DNA 连接酶 5 µl
总体积 50 µl

轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。

室温下孵育20分钟。

以下纯化步骤中使用长片段缓冲液（LFB）而非 80% 乙醇洗涤磁珠。使用乙醇将对测序反应产生不利影响。

涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠。

将 0.5× 体积（25 µL）经过重悬的 AMPure XP（AXP）磁珠加入反应体系，吹打混匀。

将离心管置于低速旋转式混匀仪（如 Hula 混匀仪）上室温孵育 10 分钟。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

用 250 μl 的长片段缓冲液（LFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置不少于 5 分钟，待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出清液并丢弃。

请注意：吸取上清液时请谨慎操作，由于缓冲液黏度较高，可能会将磁珠一同吸出。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的上清液。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于 35 µl 洗脱缓冲液中（EB）。

瞬时离心，然后在37℃下孵育10分钟。请每两分钟轻弹离心管10秒以搅动样本，促进DNA洗脱。

将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将此 35 µl 含有DNA文库的洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

将磁珠丢弃。

取 1 µl 洗脱样品，用 Qubit 荧光计定量。

请注意：连接接头后，每个样本的预计回收量为 300–500 ng。

请注意：如果上样至测序芯片的 DNA 少于 250 ng，可能会导致孔利用率下降，从而无法达到目标数据产出。

构建好的文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上或4℃条件下保存。

对于本方法，我们建议在建库完成后尽快将文库上样至测序芯片。

9. PromethION 测序芯片的预处理及上样

材料
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
  • 测序芯片系绳（FCT）
  • 文库颗粒（LIB）
  • 测序缓冲液（SB）
耗材
  • PromethION 测序芯片
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • PromethION 测序设备
  • 用于 MinKNOW 的遗传性肿瘤适应性采样文件，包括参考基因组 FASTA 文件和目标区域 BED 文件
  • PromethION 测序芯片遮光片
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头

本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-PRO114M）。

将芯片从冰箱中取出后，请将其置于室温环境孵育20分钟再插入PromethION测序仪。潮湿环境下的测序芯片上可能会形成冷凝水。因此，请检查测序芯片顶部和底部的金色连接器引脚处是否有水凝结。如有，请使用无纤维布擦干。请确保测序芯片底部有热垫（黑色）覆盖。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）、测序芯片系绳（FCT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心并置于冰上。

根据待冲洗的测序芯片数量，选择合适规格的离心管，配制测序芯片预处理液。配制完成后，短暂涡旋振荡，充分混匀。

试剂 体积（每张芯片）
测序芯片冲洗液 (FCF) 1170 µl
测序芯片系绳 (FCT) 30 µl
总体积 1200 µl

对 PromethION 24/48，请按以下步骤为测序芯片上样：

1.将测序芯片与连接器横竖对齐，以便顺利卡入。

2.用力下压芯片至卡槽，并确认卡夹位置归位。

Prom Flowcell Loading 1a 中文

Prom Flowcell Loading 1b 中文

如插入配置测试芯片的角度出现偏差，可能会损坏PromethION上的引脚并影响测序结果。如您发现 PromethION测序仪芯片位置上的引脚损坏，请通过电子邮件（support@nanoporetech.com）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们的技术支持团队。

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

请在文库上样前完成测序芯片质检，评估可用的活性纳米孔数量。

若该测序芯片此前已完成质检，则可跳过此步骤。

详细操作说明请参阅 MinKNOW 实验指南中的测序芯片质检说明部分。

顺时针滑动加液孔孔盖，将其打开。

Prom Flowcell Loading 2 中文

从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过 20-30µl 的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

在加液孔打开的状态下，按下述步骤吸取少量液体，同时避免引入气泡：

1.将P1000移液枪转至200µl刻度。

2.将枪头垂直插入加液孔中。

3.反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在 220-230 µl 之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。

Prom Flowcell Loading 3 中文

使用 P1000 移液枪向芯片的加液孔中加入 500 µl 芯片预处理溶液。加入过程中，请避免引入气泡。等待 5 分钟，与此同时，您可按以下步骤准备上样文库。

Prom Flowcell Loading 4 中文

将含有文库颗粒的 LIB 管用移液枪吹打混匀。

LIB 管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。

对于大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）。

在一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 离心管内，将所有试剂按以下顺序混合：

试剂 每张测序芯片的上样体积
测序缓冲液 (SB) 100 µl
文库颗粒 (LIB)，使用前充分混匀 68 µl
DNA 文库 32 µl
总体积 200 µl

请注意: 此处增大了文库的上样量，以增强纳米孔阵列的覆盖度。

缓慢向芯片的加液口中加入 500 µl 预处理液，完成芯片的预处理。

Prom Flowcell Loading 5 中文

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

使用 P1000 移液枪向加液孔中加入 200 µl 文库。

Prom Flowcell Loading 6 中文

合上加液孔孔盖。

Prom Flowcell Loading 7 中文

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在文库加样至测序芯片后（包括芯片清洗并重新加样时），将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

如遮光片不在测序芯片上，请您按照以下步骤安装：

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。确保遮光片的前沿位于测序芯片ID的上方。

2.用力下压芯片至卡槽，并确认卡夹位置归位。

Prom Flowcell Loading 8a 中文

Prom Flowcell Loading 8b 中文

准备就绪后，合上PromethION设备上盖。

请在为PromethION芯片上样后，等待10分钟再启动实验，以提高芯片产出。

10. 数据采集和碱基识别

如何开始测序

MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。

我们建议在测序过程中使用高精准（HAC）碱基识别模式进行实时碱基识别，并在 P24 设备上将 BAM 设为输出文件格式。

请参阅以下链接，获取有关设备设置和测序运行的详细操作说明：

下文列出了推荐的 MinKNOW 测序参数设置。

PromethION 平台遗传性肿瘤相关基因检测的 MinKNOW 参数设置

为获得最佳结果，我们强烈建议您使用 MinKNOW 25.03.7 版本。如需将 MinKNOW 恢复至 25.03.7 版本，可在此下载相关操作说明。

请确保设备中已备好用于数据采集和分析的 BED 文件。

如需确认 MinKNOW 版本是否正确，请联系 Oxford Nanopore Technologies 技术支持。

在 MinKNOW 中设置测序实验：

  • 通过桌面应用程序打开 MinKNOW 软件界面。
  • 在 MinKNOW 界面中，选择以下任一选项： 开始测序（Start sequencing，选项 1）；或 通过样本列表启动测序实验（Start from a sample sheet，选项 2）。

选项 1：选择“开始测序”（Start Sequencing）。

  • 按照屏幕提示配置测序实验，并使用以下参数。

位置

测序芯片位置：[用户定义]

实验名称：[用户定义]

测序芯片类型：FLO-PRO114M

样本 ID：[用户定义]

试剂盒

选择试剂盒： 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24）

实验配置

测序及分析

碱基识别 ：开 [默认]
修饰碱基：开，并选择“CG位点 5hmC和5mC”
模型：高精准碱基识别（HAC）[默认]

条码拆分：开 [默认]

比对：开
上传遗传性肿瘤相关基因检测数据包中提供的参考基因组文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta），供比对使用。

适应性采样：开
富集：开
过滤：关 [默认]
条码平衡：关 [默认]
仅对目标序列进行碱基识别：关 [默认]
上传遗传性肿瘤相关基因检测数据包中提供的参考基因组文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta）和目标区域文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.bed），供比对使用。

进阶选项
活性通道选择：开 [默认]
孔扫描间隔时间：1.5 [默认]
预留孔：开 [默认]

数据目标

运行限制条件：72 小时 [默认]

分析流程

工作流程：关 [默认]

输出

确保设备具有足够的存储空间：每张测序芯片至少需要 0.8 TB。

输出格式
.BAM：开 [默认]
.FASTQ：开 [默认]
文件生成基于： 运行时间 [默认]
频率： 每10分钟 [默认]
条码拆分： 按条形码拆分文件：开 [默认]
FASTQ 选项： 压缩：关

原始序列输出： 开 [默认]
.POD5：开 [默认]
.FAST5：关 [默认]
原始序列选项： 按条形码拆分.POD5文件：关 [默认]

过滤：开 [默认]
质量值：9 [默认]
最短读长：[默认]
最长读长：[默认]

选项 2：选择“通过样本列表启动测序实验”

您可以在样本列表（CSV 格式）的 alias 列中为每个条形码指定名称，该名称将在整个分析过程中沿用。样本列表还需包含所使用的测序芯片（flow_cell_product_code 列）、试剂盒（kit 列）和实验 ID（experiment_id 列）。此外，还必须提供以下两项中的一项：

  • 设备上的测序位置编号（position_ID 列）；或
  • 测序芯片 ID（flow_cell_ID 列）。

有关样本表配置选项的更多信息，请参阅 MinKNOW 文档中的上传样本列表部分。


  • 从您的文件系统中选择样本列表文件。请确保样本列表文件名的“.csv”扩展名可见，以便 MinKNOW 能够识别该文件。
  • 请按照屏幕提示完成测序实验设置，并按下文设置相关参数：

位置

测序芯片位置：[在样本列表中定义]

实验名称：[在样本列表中定义]

测序芯片类型：FLO-PRO114M

样本ID：[在样本列表中定义]

试剂盒

选择试剂盒： 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24）

实验配置

测序及分析

碱基识别 ：开 [默认]
修饰碱基：开，并选择“CG位点 5hmC和5mC”
模型：高精准碱基识别（HAC）[默认]

条码拆分：开 [默认]

比对：开
上传遗传性肿瘤相关基因检测数据包中提供的参考基因组文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta），供比对使用。

适应性采样：开
富集：开
过滤：关 [默认]
条码平衡：关 [默认]
仅对目标序列进行碱基识别：关 [默认]
上传遗传性肿瘤相关基因检测数据包中提供的参考基因组文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta）和目标区域文件（HCP_GRCh38_masked_v1.0.bed），供比对使用。

进阶选项
活性通道选择：开 [默认]
孔扫描间隔时间：1.5 [进阶]
预留孔：开 [默认]

数据目标

运行限制条件：72小时 [默认]

分析流程

工作流程：关 [默认]

输出

确保设备具有足够的存储空间：每张测序芯片至少需要 0.8 TB。

输出格式
.BAM：开 [默认]
.FASTQ：开 [默认]
文件生成基于： 运行时间 [默认]
频率： 每10分钟 [默认]
条码拆分： 按条形码拆分文件：开 [默认]
FASTQ 选项： 压缩：关

原始序列输出： 开 [默认]
.POD5：开 [默认]
.FAST5：关

原始序列选项： 按条形码拆分.POD5文件: 关 [默认]

过滤：开 [默认]
质量值：9 [默认]
最短读长：9 [默认]
最短读长：[默认]

我们不建议在同一设备上同时进行测序和数据分析。

为确保设备计算性能满足测序和/或分析需求，我们强烈建议您避免同时运行这两项任务。

请确保测序实验完成后再启动分析。数据分析应在测序结束后进行。

同样，若设备正在进行数据分析，请避免启动新的测序任务。

11. 下游分析

软件和文件要求

测序输出的 .bam 文件可使用 wf-hereditary-cancer 进行分析。该工作流程由 Oxford Nanopore EPI2ME 提供，基于 Nextflow 开发，可在 EPI2ME Desktop App中运行。运行分析前，您需要获取单独提供的 .2ME 工作流程软件包。该软件包包含参考基因组 FASTA 文件、目标区域 BED 文件以及工作流程本身。

请注意：我们不建议在同一设备上同时进行测序和数据分析。

最低硬件要求

资源 推荐配置 最低配置
CPU 16 8
内存 64 GB 32 GB
存储空间 500 GB 500 GB
  • 预计运行时间： PromethION 24 上，每个样本约 1 小时
  • 是否支持 ARM 处理器： 否
  • 兼容的操作系统： Linux、Windows 和 Mac *（*当前不支持 M 系列芯片）。

开始分析前

安装 EPI2ME 并配置工作目录

如果您的设备尚未安装 EPI2ME Desktop App（桌面应用程序），请按此处说明下载并安装。安装完成后，请按下图所示，在主控制面板中单击 “Settings”（设置），并将工作目录设置为 '/data/epi2melabs'。此举可避免分析过程中生成的文件占用系统主目录（home directory）的存储空间。


HCP_analysis_1_installation_directory



Wf-hereditary-cancer 分析工作流程以 2ME 文件的形式通过 CloudyHub 发布。相关文件的获取和下载说明，请参阅本实验指南中 开始前准备：数据包和工作流程设置 部分。


首次运行 wf-hereditary-cancer：安装工作流程 2ME 软件包

如果您是首次运行 wf-hereditary-cancer，请按照以下步骤安装该工作流程的 2ME 软件包：

1. 打开 EPI2ME 桌面应用程序，从左侧菜单中选择 Launch （启动）。


2. 在界面右侧单击 Import workflow（导入工作流程），然后在下拉菜单中选择 Import a 2ME file（导入 2ME 文件）。

HCP_analysis_5_import_workflow


3. 在弹出的窗口中，确保已选择 Select a file（选择文件），然后单击 Select a path（选择路径），浏览并选择已下载的 2ME 文件。

3-pop-up


4. 点击 Install（安装）。应用程序将安装该工作流程。安装相关容器可能需要几分钟。

4-click-install


5. 安装成功后，系统将显示相应的提示信息。关闭弹窗。至此，工作流程安装完成，可开始使用。

5-successful-install


6. 如需验证安装是否成功，可使用该工作流程附带的演示数据集进行测试：在 Installed workflows（已安装的工作流程）页面选择 wf-hereditary-cancer；然后在 Options（选项）下拉菜单中，选择 Run demo analysis（运行演示分析）。然后选择 Launch（启动）。

HCP_analysis_9_Install_demo

使用 wf-hereditary-cancer 工作流进行分析

运行工作流程:

1.启动 EPI2ME 桌面应用程序。


2.在已安装的工作流程页面下选择wf-hereditary-cancer，然后选择Launch（启动）。

HCP_analysis_2_select_wf_hcp

HCP_analysis_3_select_wf_hcp_launch


3.在 Main options（主要选项）中，指定存放样本 BAM 文件的文件夹（例如 barcode01）的路径。请注意，工作流程需针对每个样本分别运行。默认情况下，最终输出报告中的样本名称与文件夹名称相同。如需使用其他样本名称，请在 Sample Name（样本名称）字段中输入该名称。

HCP_analysis_4_path_to_BAM


4.点击 Launch workflow（启动工作流程）。

在 Oxford Nanopore 的 PromethION 和 GridION 设备上运行该工作流程时， Multiprocessing Options（多进程选项）和 Nextflow configuration（Nextflow 配置）中的默认设置即可满足要求。我们建议其他所有参数保持默认设置。

输出文件

wf-hereditary-cancer 会生成多个交互式 HTML 报告，其中包含数据质量指标、目标区域覆盖度以及变异检测结果等信息。该工作流程还会生成其他输出文件，供后续分析和数据探索使用，包括用于三级变异注释的变异检测结果（.vcf），以及可导入基因组浏览器进行分析的带单倍型标签的比对文件（.bam）和甲基化文件（.bedmethyl）。

12. 测序芯片的重复利用及回收

采用本方法完成实验后，不建议清洗并重复使用测序芯片。

由于本实验测序时间较长，且需多次清洗测序芯片并重新上样，因此不建议在实验完成后重复使用该测序芯片，以免数据产出不足，无法满足后续分析需求。

请按照回收程序将测序芯片返还至 Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。

13. 遗传性肿瘤相关基因检测疑难解答

测序期间未启用实时碱基识别，我该怎么办？

线下碱基识别

如您在测序过程中未使用推荐的 HAC（高精准）模型进行实时碱基识别，可使用独立版 Dorado 软件对数据进行线下碱基识别。如需通过命令行执行，请参阅 GitHub 页面 中的相关说明。

您也可以使用 wf-basecalling 工作流程对数据进行碱基识别。该工作流既支持 通过命令行 运行，也可在 EPI2ME Desktop App 中使用。

请注意： 我们强烈建议您在测序过程中启用实时碱基识别。Oxford Nanopore 尚未验证线下碱基识别在遗传性癌症分析工作流程中的应用。

DNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

下表列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。


低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
低纯度DNA（Nanodrop 测定的 DNA 吸光度比值 260/280<1.8，260/230 <2.0-2.2） 用户所使用的 DNA 提取方法未能达到所需纯度 您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对后续文库制备和测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。

请考虑将样品再次用 AMPure 磁珠纯化。

经 AMPure 磁珠纯化后的 DNA 回收率低

现象 可能原因 措施及备注
低回收率 AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失 1.AMPure 磁珠沉降速度较快，因此在将磁珠加入样品前，请务必充分重悬混匀。

2.当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。
低回收率 DNA片段短于预期 AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，据此计算出合适的AMPure磁珠用量。SPRI cleanup
末端修复后的DNA回收率低 清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

测序过程中可能出现的问题

以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。


MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。如何为 PromethION 测序芯片上样视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片牢固嵌入测序仪中，并已到达目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它芯片槽进行测序。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

MinKNOW 脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW日志文件并联系我们的技术支持。如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于 40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不够 在人类基因组测序方案中，应向 R10.4.1 测序芯片加载 250–300 ng 的高质量文库，以保持较高的纳米孔利用率。
纳米孔利用率接近0 使用连接测序试剂盒；但在接头连接后的纯化步骤中并未使用LFB 或SFB洗涤，而是使用了酒精 酒精可导致测序接头上的马达蛋白变性。请确保在测序接头连接后使用洗涤缓冲液（LFB或SFB）。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳（FCT 管）随测序芯片预处理液加至芯片。请确保在制备预处理液时，将测序芯片系绳（FCT）加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

读长短于预期

现象 可能原因 措施及备注
读长短于预期 DNA样本降解 读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。

1.请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案.

2.在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。! DNA gel2 在上图中，样本 1 为高分子量 DNA，而样本 2 为降解样本。

3.

3.在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于不可用状态 (在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示)

image2022-3-25 10-43-25 上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。		 样本中含有污染物 使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔"（sequencing pore）。若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加：

用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒 (EXP-WSH004)进行核酸酶冲洗 操作。

大量纳米孔处于“失活”（Inactive）状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤 测序芯片中引入了气泡 芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看如何为 PromethION 测序芯片上样了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 存在与DNA共纯化的化合物 已知的化合物包括多糖等。

1.使用 QIAGEN PowerClean Pro 试剂盒进行纯化。
2.利用QIAGEN REPLI-g 试剂盒对原始 gDNA 样本进行全基因组扩增。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在Contaminants 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）的降低。请调整测序仪的摆放位置，确保将其置于室温下、通风良好的环境中，再在MinKNOW中重启进程。
Oxford Nanopore Technologies, the Wheel icon, AmPORE-TB, EPI2ME, GridION, MinION, MinKNOW, PromethION, P2 Solo, and P2 are registered trademarks or the subject of trademark applications of Oxford Nanopore Technologies plc in various countries. Information contained herein may be protected by copyright, patents or patents pending of Oxford Nanopore Technologies plc. All other brands and names contained are the property of their respective owners. Oxford Nanopore Technologies products are RUO. Products labelled/branded as Oxford Nanopore Diagnostics may be RUO or may be regulated as in‐vitro diagnostic devices in some jurisdictions, please check individual product labelling. ONT plc is a member of the producer compliance scheme run by ERP UK Ltd, who manage the submission of documentation in support of WEEE compliance for ONT plc’s manufacture and supply of Electrical and Electronic equipment in the UK. ONT’s WEEE PRN is WEE/MM3828AA.

Last updated: 7/15/2026

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