Este protocolo describe el proceso de extracción de ADN, la preparación de la biblioteca y el análisis del Panel de cáncer hereditario (HCP) con 3 muestras por celda de flujo PromethION, con el kit Native Barcoding y la función de enriquecimiento de regiones seleccionadas mediante muestreo adaptativo en MinKNOW. Todos los reactivos necesarios en el protocolo están incluidos en el paquete Panel de cáncer hereditario, disponible en formato de 18 o 72 muestras. Además, incluye el kit Native Barcoding y, junto con el resto de elementos de secuenciación, constituye la configuración estándar de este flujo de trabajo.

Si se procesan varias muestras, tenga en cuenta que en la preparación de la biblioteca deberán agruparse de tres en tres.

Descripción detallada del flujo de trabajo

Preparación del experimento

Pasos:

• Extraer la muestra de partida (sangre o ADN).
• Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
• Descargar el programa que obtendrá y analizará los datos.
• Verificar la celda de flujo y comprobar que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de muestras, preparación de bibliotecas y secuenciación

Etapa	Proceso	Duración	Parada opcional
Preparación de muestras	Extraer el ADN genómico de la muestra, fragmentarlo y cuantificarlo. Comprobar la longitud, cantidad y pureza del material extraído. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.	De 4 a 6 horas	En esta etapa, es posible guardar el ADN extraído o fragmentado a –20 °C y utilizarlo más adelante.
Reparación del ADN y preparación de los extremos	Reparar el ADN y preparar los extremos para la ligación de adaptadores.	60 minutos	4 °C durante la noche
Ligación directa de códigos de barras	Ligar los códigos de barras (sin PCR) a los extremos del ADN.	70 minutos	4 °C durante la noche
Ligación de adaptadores de secuenciación y purificación	Ligar los adaptadores a los extremos de ADN.	60 minutos	a 4 °C durante almacenamientos a corto plazo o en caso de uso repetido, como las recargas de celdas de flujo. a –80 °C durante almacenamientos a largo plazo.
Acondicionar y cargar la celda de flujo	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN en ella.	10 minutos
Secuenciación	Secuenciar la biblioteca con el dispositivo de secuenciación.	72 horas
Análisis de datos	Análisis con el paquete de datos de HCP	120 minutos

Al registrarse en Hereditary Cáncer Profiling (HCP), recibirá por correo electrónico el enlace a una ubicación de almacenamiento que contiene el paquete de datos necesario para iniciar y analizar el experimento. Dicho paquete, diseñado especialmente para este producto, garantiza una configuración y compatibilidad fiables. En la sección Análisis de datos de este protocolo, encontrará instrucciones de instalación del archivo 2ME en EPI2ME, incluyendo cómo probarlo con datos de demostración.

El paquete de datos contiene:

• Archivos de muestreo adaptativo que se utilizan en MinKNOW: un genoma de referencia FASTA y un archivo BED con las regiones seleccionadas, utilizadas durante la secuenciación para enriquecer esas regiones.

• Archivos del flujo de trabajo destinados al análisis bioinformático en EPI2ME (2ME).

• Archivos de ejemplo

Si ha comprado el paquete de Cáncer hereditario y no ha recibido un correo electrónico de la plataforma Oxford Nanopore CloudHub con un enlace seguro a los archivos necesarios, contacte con el equipo de asistencia (support@nanoporetech.com) indicando el ID del pedido y haremos lo posible por ayudarle.

Todos los reactivos necesarios en este protocolo están incluidos en el paquete del Panel de cáncer hereditario y está disponible en la tienda Nanopore en formato de 18 (HCP18) o 72 (HCP72) muestras.

El paquete incluye el kit Native Barcoding junto con el resto de elementos de secuenciación y constituye la configuración estándar de este flujo de trabajo.

Si desea más información sobre elementos concretos del kit incluidos en el paquete, consulte los productos correspondientes en la tienda Nanopore:

• Panel de Cáncer Hereditario: paquete de 18 muestras (HCP18)
• Panel de Cáncer Hereditario: paquete de 72 muestras (HCP72)

Método de extracción (por muestra):

• ≥ 1 ml de sangre humana en un tubo de extracción al vacío con EDTA K2

Preparación de la biblioteca (por muestra):

• ~1 µg de ADNg fragmentado

Control de calidad del ADN de partida

Es importante que el ADN de partida cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), afecta a la preparación de la biblioteca.

Siga las instrucciones sobre cómo realizar un control de calidad de la muestra de ADN, en el protocolo Input DNA/ RNA QC.

Contaminantes químicos

Según cómo se extraiga el ADN de la muestra original, ciertos contaminantes químicos quedan en el ADN purificado y afectan tanto a la eficacia de la preparación de la biblioteca como a la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha evaluado otras alternativas.

A menos que se especifique en el protocolo, recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos comprobar el número de poros disponibles presentes en la celda de flujo, en un plazo de 12 semanas desde la compra de las celdas de flujo PromethION. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Encontrará más información en las instrucciones en el documento Flow Cell Check.

Celdas de flujo	Cantidad mínima de poros activos cubierta por la garantía
PromethION	5 000

• Si se utiliza sangre fresca o sangre conservada a 4 °C, proceder a la extracción del ADN.
• Si se utiliza sangre congelada, comprobar que la muestra esté completamente descongelada antes de continuar.

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real.

Recomendamos identificar las bases con el modo de gran precisión HAC, con salida en formato BAM.

Consulte en los enlaces a continuación las instrucciones de configuración del dispositivo y el experimento de secuenciación:

• PromethION 24: "Starting a sequencing run with PromethION 24"

A continuación se indican los parámetros de secuenciación recomendados en MinKNOW.

A fin de obtener resultados óptimos, recomendamos utilizar MinKNOW 25.03.7. Las instrucciones de restablecimiento de MinKNOW 25.03.7 están disponibles aquí

Comprobar que dispone de los archivos BED adecuados, necesarios en la adquisición de datos y el análisis.

Si necesita confirmar que está utilizando la versión correcta de MinKNOW, póngase en contacto con un representante de Oxford Nanopore Technologies.

Configuración de experimentos de secuenciación en MinKNOW:

• Abrir la interfaz del programa mediante la aplicación de escritorio.
• En la interfaz de MinKNOW, seleccionar entre Iniciar la secuenciación (opción 1) o Partir de una hoja de muestras (opción 2).

• Seguir en pantalla la configuración del experimento, utilizando los ajustes especificados a continuación:

Posiciones

Posición de celda de flujo: [definida por el usuario]

Nombre del experimento: [definido por el usuario]

Tipo de celda de flujo: FLO-PRO114M

ID de la muestra: [definido por el usuario]

Kit

Selección del kit: Native Barcoding Sequencing Kit (SQK-NBD114. 24)

Configuración del experimento

Secuenciación y análisis

Identificación de bases: Activado [predeterminado]
Bases modificadas: Activado con "contextos CG 5mC & 5hmC" seleccionados
Modelo: Identificación de bases de gran precisión (HAC)[predeterminado]

Adición de códigos de barras: Activado [predeterminado]

Alineamiento: Activado
Cargar el archivo del genoma de referencia incluido en el paquete de archivos del Panel de cáncer hereditario (HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta) como referencia de alineamiento
Muestreo adaptativo: Activado
Enriquecer: Activado
Excluir: Desactivado [predeterminado]

Equilibrado de códigos de barras: Desactivado [predeterminado]
Identificación de bases solo en regiones de interés Desactivado [predeterminado]
Cargar el archivo del genoma de referencia (HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta) y el de la región objetivo (HCP_GRCh38_masked_v1.0.bed) proporcionado en el paquete de archivos del Panel de cáncer hereditario, que se emplearán en el alineamiento

Opciones avanzadas
Selección del canal activo: Activado [predeterminado]
Intervalo entre escaneos de poros: 1,5 [predeterminado]
Reservar poros: Activado [predeterminado]

Objetivos de datos

Duración máxima de la ejecución: 72 horas [predeterminado]

Flujo de trabajo bioinformático

Flujo de trabajo: Desactivado [predeterminado]

Salida de datos

Comprobar que hay suficiente espacio en el dispositivo: un mínimo de 0,8 TB por celda de flujo.

Formato de salida
BAM: Activado [predeterminado]
FASTQ: Activado [predeterminado]
En función de: Tiempo transcurrido [predeterminado]
Frecuencia: Cada 10 minutos [predeterminado]
Adición de códigos: Dividir archivos por código de barras: Activado [predeterminado]
Opciones de FASTQ Compresión: Desactivada

Salida de lecturas sin procesar: Activado [predeterminado]
POD5: Activado [predeterminado]
FAST5: Desactivado [predeterminado]
Opciones de lecturas sin procesar: Dividir archivos POD5 por códigos de barras: Desactivado [predeterminado]

Filtrado: Activado [predeterminado]
Índice de calidad Qscore: 9 [predeterminado]
Longitud de lectura mínima: [predeterminado]
Longitud de lectura máxima: [predeterminado]

Partir de una hoja de muestras (formato CSV) asigna un nombre a cada código de barras que se mantendrá durante todo el análisis (columna alias). La hoja de muestras especifica qué celda de flujo (columna flow_cell_product_code) y kit (columna kit) se utilizan. Además, es necesario incluir una columna para el experimento y otra para el número de posición en el dispositivo (position_ID) o el identificador de la celda de flujo (flow_cell_ID). Es obligatorio añadir una columna en cualquiera de los dos casos.

Encontrará más información sobre hojas de muestras en la sección Sample sheet upload de la documentación de MinKNOW.

• Seleccionar el archivo de la hoja de muestras en el sistema de archivos. Procure que el nombre de la hoja de muestras tenga visible la extensión ".csv", de modo que MinKNOW lo reconozca.
• Seguir en pantalla la configuración del experimento, utilizando los ajustes especificados a continuación:

Posiciones

Posición de celda de flujo: [especificada en la hoja de muestras]

Nombre del experimento: [especificado en la hoja de muestras]

Tipo de celda de flujo: FLO-PRO114M

ID de la muestra: [especificado en la hoja de muestras]

Kit

Selección del kit: Native Barcoding Sequencing Kit (SQK-NBD114. 24)

Configuración del experimento

Secuenciación y análisis

Identificación de bases: Activado [predeterminado]
Bases modificadas: Activado con "contextos CG 5mC & 5hmC" seleccionados
Modelo: Identificación de bases de gran precisión (HAC)[predeterminado]

Adición de códigos de barras: Activado [predeterminado]

Alineamiento: Activado
Cargar el archivo del genoma de referencia incluido en el paquete de archivos del Panel de cáncer hereditario (HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta) como referencia de alineamiento

Muestreo adaptativo: Activado
Enriquecer: Activado
Excluir: Desactivado [predeterminado]
Equilibrado de códigos: Desactivado [predeterminado]
Identificación de bases solo en regiones de interés: Desactivado [predeterminado]
Cargar el archivo del genoma de referencia (HCP_GRCh38_masked_v1.0.fasta) y el de la región objetivo (HCP_GRCh38_masked_v1.0.bed) proporcionado en el paquete de archivos del Panel de cáncer hereditario, que se emplearán en el alineamiento

Opciones avanzadas
Selección del canal activo: Activado [predeterminado]
Intervalo entre escaneos de poros: 1,5 [predeterminado]
Reservar poros: Activado [predeterminado]

Objetivos de datos

Duración máxima de la ejecución: 72 horas [predeterminado]

Flujo de trabajo bioinformático

Flujo de trabajo: Desactivado [predeterminado]

Salida de datos

Comprobar que haya suficiente espacio en el dispositivo: mínimo un 0,8 TB por celda de flujo.

Formato de salida
BAM: Activado [predeterminado]
FASTQ: Activado [predeterminado]
En función de: Tiempo transcurrido [predeterminado]
Frecuencia: Cada 10 minutos [predeterminado]
Adición de códigos de barras: Dividir archivos por código de barras: Activado [predeterminado]
Opciones de FASTQ Compresión: Desactivado

Salida de lecturas sin procesar: Activado [predeterminado]
POD5: Activado [predeterminado]
FAST5: Desactivado [predeterminado]
Opciones de lecturas sin procesar: Dividir archivos POD5 por código de barras: Desactivado [predeterminado]

Filtrado: Activado [predeterminado]
Índice de calidad Qscore: 9 [predeterminado]
Longitud de lectura mínima: [predeterminado]
Longitud de lectura máxima: [predeterminado]

Los archivos de salida (.bam) se analizan con wf-hereditary-cancer, un flujo de trabajo bioinformático desarrollado por Nextflow, que forma parte de la plataforma de análisis de datos EPI2ME, de Oxford Nanopore. Este flujo de trabajo se ejecuta dentro de la aplicación EPI2ME Desktop, lo que requiere disponer del paquete del flujo de trabajo (genoma de referencia en formato FASTA, el archivo BED con las regiones objetivo y el propio flujo de trabajo) distribuido por separado como archivo 2ME.

No recomendamos secuenciar y analizar datos a la vez en el mismo dispositivo.

Elemento	Recomendación	Mínimo
CPU	16	8
Memoria	64 GB	32 GB
Almacenamiento	500 GB	500 GB

• Tiempo de ejecución aproximado: aproximadamente 1 hora por muestra en un PromethION 24
• Compatible con procesador ARM: falso
• Sistemas operativos compatibles: Linux, Windows, Mac*(los procesadores de la serie *M no son compatibles).

Instalación de EPI2ME y configuración de la carpeta de trabajo

Si no está ya instalado en el dispositivo, siguiendo estas instrucciones es posible descargar e instalar la aplicación EPI2ME Desktop. Una vez instalado, en el panel principal pulsar en "Settings" y comprobar que la carpeta de trabajo esté configurada como ‘/data/epi2melabs’ como se muestra a continuación, lo que garantizará que los archivos generados por el flujo de trabajo durante el análisis no llenen la carpeta personal del usuario:

El flujo de trabajo bioinformático wf-hereditary-cancer se distribuye en un archivo 2ME a través de CloudHub. Consulte cómo acceder y descargar esos archivos en la sección Antes de empezar: paquete de datos y configuración del flujo de trabajo.

Ejecutar wf-hereditary cancer por primera vez: instalar el flujo de trabajo del paquete 2ME

Si ejecuta este flujo de trabajo por primera vez, siga los siguientes pasos a fin de instalar el flujo de trabajo del paquete 2ME:

1. Abrir la aplicación de escritorio EPI2ME y seleccionar Launch en el menú de la izquierda.

2. A la derecha de la pantalla, seleccionar Import workflow y en el menú desplegable, seleccionar Import a 2ME file.

3. En la ventana emergente, seleccionar la opción Select a file y a continuación Select a path a fin de navegar hacia la ubicación del archivo 2ME descargado.

4. Pulsar Install. La aplicación procederá a instalar el flujo de trabajo, lo que tardará unos minutos, ya que instalará los contenedores necesarios.

5. Un mensaje confirmará si la instalación se ha realizado correctamente. Cerrar la ventana emergente El flujo de trabajo se ha instalado y está listo para utilizarse.

6. Si desea probar la instalación con datos de demostración proporcionados con el flujo de trabajo, en la pestaña Installed workflows seleccionar wf-hereditary-cancer. A continuación, en el menú desplegable Options, seleccionar Run demo analysis. Pulsar Launch.

Ejecutar el flujo de trabajo:

1. Iniciar la aplicación EPI2ME Desktop.

2. En la pestaña Installed workflows seleccionar wf-hereditary-cancer. Pulsar Launch.

3. En Main options, introducir la ruta al archivo que contiene el BAM de la muestra (ej. barcode01). Tenga en cuenta que el flujo de trabajo debe ejecutarse por separado con cada muestra. Si desea utilizar un nombre distinto al de la carpeta en el informe de resultados, introdúzcalo en el campo Sample Name.

4. Pulsar Launch workflow.

Los valores predeterminados de las opciones Multiprocessing Options y Nextflow configuration son compatibles con la ejecución de flujos de trabajo en dispositivos PromethION y GridION. Recomendamos dejar el resto de parámetros en sus valores predeterminados.

El flujo de trabajo wf-hereditary-cancer genera varios informes interactivos HTML con información sobre parámetros de calidad de los datos, la cobertura en las regiones objetivo y las variantes detectadas. También genera archivos complementarios que se utilizan en el análisis y exploración posteriores, incluidos los archivos de variantes (.vcf), que se utilizan en el análisis terciario de anotación de variantes, así como los archivos de alineamiento con etiquetado de haplotipos y de metilación (.bam, .bedmethyl), útiles en la inspección de datos en un navegador genómico.

Debido al prolongado tiempo de secuenciación y a los múltiples lavados de las celdas de flujo y recargas de bibliotecas, no recomendamos reutilizar las celdas de flujo que se utilicen en este protocolo.

Reutilizar las celdas de flujo en experimentos posteriores provoca que se generen datos insuficientes, lo que dificulta su análisis.

Identificación de bases posejecución

Si los datos no se secuenciaron en tiempo real con el modelo recomendado HAC, es posible identificar las bases con la versión independiente del programa Dorado. Si desea hacerlo desde la línea de comandos, siga las instrucciones en la página de Github.

Es posible identificar las bases de los datos con el flujo de trabajo wf-basecalling workflow, desde la línea de comandos y desde la aplicación de escritorio EPI2ME.

Tenga en cuenta que nosotros recomendamos identificar bases en tiempo real. Oxford Nanopore no ha validado la identificación de bases posejecución en este flujo de trabajo de perfilado de cáncer hereditario.

A continuación, hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop del ADN con una relación OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento técnico Contaminants. Probar con otro método de extracción que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza con microesferas AMPure.

Baja recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas AMPure

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto	1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra deben estar bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	En el paso de lavado se utilizó etanol en una concentración inferior al 70 %	Si se utiliza etanol a una concentración inferior al 70 %, el ADN se eluye de las microesferas. Utilice el porcentaje correcto.

A continuación, hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras la evaluación de la celda de flujo

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos.	Tras comprobar la celda de flujo y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas de aire que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, las burbujas son capaces de desplazarse hacia la matriz de nanoporos y dañar los nanoporos expuestos al aire de manera irreversible. En el vídeo Cómo cargar una celda de flujo PromethION se muestran algunas buenas prácticas evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La celda de flujo no está colocada correctamente.	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros.	El recuento de poros durante la evaluación de la celda de flujo se efectúa utilizando las moléculas de ADN del control de calidad presentes en el amortiguador de almacenamiento. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca a fin de calcular el número de poros activos. Por este motivo, se estima que existe una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación suele estar relacionado con la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. En algunos casos, recomendamos emplear métodos alternativos de extracción o purificación de ADN/ARN a fin de mejorar la pureza del material de partida. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción diferente que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema persiste, reúna los archivos de registro de MinKNOW y contacte con el departamento de Asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica, que proporcionará instrucciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poros por debajo del 40 %

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poros inferior al 40 %	No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo.	En protocolos de secuenciación de genoma humano, deben cargarse 250-300 ng de biblioteca de buena calidad en una celda de flujo R10.4.1 a fin de mantener la ocupación de poros elevada.
Ocupación de poros próxima a 0	Se utilizó el kit Ligation Sequencing y en la fase de lavado, después de ligar el adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).	El etanol desnaturaliza la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poros próxima a 0	No hay anclaje en la celda de flujo.	Los anclajes se añaden durante el acondicionamiento de la celda de flujo (tubo FCT). Añadir FCT al vial FCF antes de acondicionar la celda de flujo.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN tiende a fragmentarse durante la extracción y la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de longitudes de fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene un elevado peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evite pipetear y agitar en vórtex al mezclar los reactivos. Dar suaves golpecitos con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles».	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "poro en secuenciación". Si la porción de poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta: realizar un lavado con nucleasa con el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004).

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas han sufrido daños irreversibles)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca provocan daños permanentes. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Ciertos compuestos copurificados con ADN	Ciertos compuestos, incluyen polisacáridos. 1. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro. 2. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg con el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento técnico Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar hasta que las clavijas del conector estén firmemente en contacto con el dispositivo. Si el problema persiste, contacte con el servicio de Asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje «Error al intentar alcanzar la temperatura deseada»	El dispositivo se colocó en una ubicación con una temperatura ambiente inferior a la media o con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW establece un intervalo de tiempo para que la celda de flujo alcance la temperatura fijada. Si se supera el tiempo establecido, aparecerá un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continuará. Secuenciar a una temperatura incorrecta suele provocar una disminución en el rendimiento y generar índices de calidad Q score menores. Corregir la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reiniciar el proceso en MinKNOW.