Este protocolo completo describe nuestra Solución de secuenciación de aislados microbianos exclusivo de Nanopore (NO-MISS): un enfoque flexible que permite secuenciar de 4 a 24 genomas de aislados microbianos por celda de flujo MinION y generar una cobertura mínima de 50x por genoma.

El umbral de cobertura de 50x es suficiente para realizar los análisis posteriores, entre ellos el ensamblaje y la resolución precisa de plásmidos, la detección de resistencia a los antimicrobianos (AMR), la tipificación multilocus del genoma central (cgMLST) y del genoma completo (wgMLST), así como la tipificación cg/wgSNP. EPI2ME, que proporciona un flujo bioinformático fácil de usar, está disponible para analizar los datos.

Ofrecemos múltiples métodos de extracción de ADN, en función de los requisitos y del organismo de partida (bacterias, hongos/levaduras). Estos son fundamentales para lograr un rendimiento fiable de la celda de flujo y la cobertura del genoma. Los métodos de extracción específicos de cada muestra utilizan el kit NEB Monarch® Spin gDNA Extraction Kit, mientras que el método general utiliza una homogeneización con microesferas y el kit Maxwell® RCS PureFood Pathogen Kit.

Acto seguido, el ADNg se somete a tagmentación y se secuencia con nuestro Rapid Barcoding Kit (SQK-RBK114.24 o SQK-RBK114.96). Es posible procesar hasta 24 muestras por experimento de secuenciación en el caso de aislados bacterianos (genomas de hasta 7 Mb) y hasta 8 muestras en el caso de aislados de hongos/levaduras, con el fin de alcanzar el umbral de cobertura de 50x. Utilice un mínimo de cuatro códigos de barras por ejecución para mantener el rendimiento.
Incluimos también instrucciones detalladas para configurar la secuenciación en MinKNOW y el análisis posterior, con el fin de ofrecer un protocolo completo. Recomendamos secuenciar hasta 72 horas y generar al menos una cobertura de 50x por muestra (aproximadamente 0,5 Gb por código de barras, partiendo de un tamaño genómico de 5 Mb).

Antes de iniciar una un experimento de secuenciación, recomendamos actualizar MinKNOW. El modelo de identificación de bases v4.3, disponible a partir de Dorado 0.5.0, ofrece una mayor precisión en el ADN bacteriano y está incluido en MinKNOW 24.02 o versiones posteriores.

Encontrará más información sobre la actualización de MinKNOW en nuestro protocolo de MinKNOW.

Descripción general del flujo de trabajo completo

Pasos del flujo de trabajo de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

• Extraer el ADN y comprobar su cantidad y la pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
• Disponer del kit de secuenciación, el equipo adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
• Descargar el programa informático que obtiene y analiza los datos.
• Comprobar la celda de flujo y asegurarse de que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la muestra

Mediante el método de extracción de ADNg pertinente, deberá lisar las células, extraer el ADNg y cuantificarlo:

• Método general de homogeneización con microesferas:
• Extracción general de ADNg mediante homogeneización con microesferas:
  • Indicado en casos de elevado rendimiento y aplicaciones generales.

• Métodos manuales de extracción mediante columnas de sílice:
• Extracción de ADN genómico bacteriano:
  • Bacterias como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis y Bacillus subtilis, o estafilococos como Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.
• Extracción de ADNg de organismos difíciles de lisar:
  • Bacterias como Mycobacterium tuberculosis.
• Extracción de ADN genómico de hongos:
  • Hongos/levaduras, como Candida albicans, Candida tropicalis y Candida parapsilosis.

Preparación de la biblioteca

La siguiente tabla es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca, incluyendo la duración y las paradas opcionales.

Preparación de la biblioteca	Proceso	Duración	Parada opcional
Etiquetado del ADN con códigos de barras	Tagmentación del ADN con el Rapid Barcoding Kit V14	15 minutos	4 °C durante la noche
Agrupación y purificación de muestras	Agrupar las bibliotecas y purificarlas con microesferas AMPure XP	25 minutos	4 °C durante la noche
Unión del adaptador rápido	Unir los adaptadores de secuenciación a los extremos de ADN	5 minutos	Recomendamos vivamente secuenciar la biblioteca tan pronto como se hayan incorporado los adaptadores
Preparación y carga de la celda de flujo	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca	10 minutos

Secuenciación y análisis
Pasos:

• Iniciar un experimento de secuenciación con el software MinKNOW, que recopilará datos sin procesar, identificará las bases y demultiplexará las lecturas con código de barras.
• Realizar el análisis de datos en EPI2ME mediante el modo isolate del flujo de trabajo wf-bacterial-genomes.

Requisitos de cantidad por muestra según el método de extracción:

• Extracción general de ADN genómico mediante homogeneización con microesferas: 1 ml de cultivo líquido incubado durante la noche (~1 × 10⁸–10⁹ UFC/ml) o media asa de colonias procedentes de una placa

• Extracción de ADN genómico bacteriano: 200 µl de cultivo líquido incubado durante la noche (~1 × 10⁸–10⁹ UFC/ml) o 1/8 de un asa de colonias procedentes de una placa

• Extracción de ADN genómico en organismos difíciles de lisar: 5 – 10 mg de células de medios sólidos o líquidos

• Extracción de ADN genómico de hongos: 2 ml de cultivo incubado durante la noche con una concentración aproximada de ~1 × 10⁷ UFC/ml o un asa de siembra de 10 µl de colonias procedentes de una placa

En la preparación de la biblioteca, se requieren 200 ng en 10 µl de ADN genómico extraído por muestra.

Según el protocolo de extracción que se utilice, no serán necesarios todos los reactivos de otros fabricantes.

Hemos validado y recomendamos el uso de los reactivos de otros fabricantes utilizados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha probado otras alternativas.

Respecto a los reactivos de otros fabricantes, recomendamos seguir las instrucciones del fabricante.

Es posible preparar un tampón CTAB personalizado en lugar de comprarlo. A continuación se indican los reactivos y las concentraciones necesarios, con ejemplos sugeridos que incluyen un margen adicional.

Reactivo	Existencias	Concentración final	Volumen 12 muestras	Volumen 24 muestras
CTAB	-	2 % v/v	60 µl	120 µl
EDTA	0,5 M	40 mM	240 µl	480 µl
Cloruro de sodio	5 M	1,4 M	833 µl	1 666 µl
Solución de clorhidrato de Trizma, pH 8	1 M	100 mM	300 µl	600 µl
Agua libre de nucleasas	-	-	1 567 µl	3 134 µl
Total	-	-	3 000 µl	6 000 µl

El tampón de lisis estafilocócico (SLB) es necesario en el método de extracción de ADNg bacteriano con muestras de Staphylococcus.

Reactivo	Existencias	Concentración final	Volumen (12 muestras con excedente)	Volumen (24 muestras con excedente)
Solución de clorhidrato de Trizma, pH 9	1 M	100 mM	150 ul	300 µl
Cloruro de sodio	5 M	10 mM	3 ul	6 µl
SDS	10 % v/v	0,1 % v/v	15 ul	30 µl
Agua sin nucleasas	-	-	1 332 ul	2 664 µl
Volumen total	-	-	1 500 ul	3 000 µl

El SDS del tampón de lisis estafilocócico (SLB) es esencial en la prevención de la degradación del ADN de los estafilococos. Excluir el SDS del tampón da como resultado una mayor difuminación del ADN cuando se ejecuta en un gel.

Control de calidad del ADN inicial

Es importante que el ADN inicial cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Encontrará instrucciones sobre cómo realizar el control de calidad de la muestra de ADN en el Protocolo de control de calidad del ADN/ARN inicial.

Contaminantes químicos

Según el método empleado para extraer el ADN de la muestra original, es posible que ciertos contaminantes químicos permanezcan en el ADN purificado, lo que afecta a la eficiencia de la preparación de la biblioteca y a la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminantes de la comunidad.

Recomendamos comprobar el número de poros de la celda de flujo antes de iniciar un experimento de secuenciación. Esto debe hacerse en un plazo de 12 semanas desde la compra de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION o en un plazo de cuatro semanas desde la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre que el resultado se comunique en un plazo de dos días tras realizar la comprobación de la celda de flujo y se hayan seguido las recomendaciones de almacenamiento. Realizar la comprobación del flow cell siguiendo las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celdas de flujo	Número mínimo de poros activos cubiertos por la garantía
MinION/GridION	800
PromethION	5 000

Estamos cambiando el fomato de los códigos de barras incluidos en este kit por un formato en placa., lo que reducirá la producción de residuos plásticos y favorecerá el uso en aplicaciones automatizadas.

Formato en placa

Nombre	Acrónimo	Color del tapón	Número de viales	Volumen por vial (µl)
Rapid Adapter	RA	Verde	1	15
TAdapter Buffer	ADB	Transparente	1	100
AMPure XP Beads	AXP	Ámbar	2	1200
Elution Buffer	EB	Negro	1	500
Sequencing Buffer	SB	Rojo	1	700
Library Beads	LIB	Rosa	1	600
Library Solution	Tapón blanco, etiqueta rosa	1	600
Flow Cell Flush	FCF	Tapón transparente, etiqueta azul claro	1	8000
Flow Cell Tether	FCT	Morado	1	200
Placa de códigos de barras rápidos	RB01-24	-	2 placas, 3 juegos de códigos de barras por placa	5 µl por pocillo

Este producto contiene reactivo AMPure XP fabricado por Beckman Coulter, Inc. y puede almacenarse a -20 °C con el kit sin que ello afecte a la estabilidad del reactivo.

Formato del vial

Nombre	Sigla	Color del tapón	N.º de viales	Volumen por vial (µl)
Rapid Adapter	RA	Verde	1	15
Adapter Buffer	ADB	Transparente	1	100
Microesferas AMPure XP	AXP	Ámbar	2	1 200
Elution Buffer	EB	Negro	1	500
Sequencing Buffer	SB	Rojo	1	700
Library Beads	LIB	Rosa	1	600
Library Solution	LIS	Tapón blanco, etiqueta rosa	1	600
Flow Cell Flush	FCF	Azul	6	1 170
Flow Cell Tether	FCT	Violeta	1	200
Códigos de barras rápidos	RB01-24	Transparente	24	15

Este producto contiene reactivo AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter, Inc. y puede almacenarse a -20 °C con el kit sin que ello afecte a la estabilidad del reactivo.

Nombre	Sigla	Color del tapón	N.º de viales	Volumen por vial (µl)
Rapid Adapter	RA	Verde	2	15
Adapter Buffer	ADB	Transparente	1	100
microesferas AMPure XP	AXP	Ámbar	3	1 200
Elution Buffer	EB	Negro	1	1 500
Sequencing Buffer	SB	Rojo	1	1 700
Library Beads	LIB	Rosa	1	1 800
Library Solution	LIS	Tapón blanco, etiqueta rosa	1	1 800
Flow Cell Flush	FCF	Transparente	1	15 500
Flow Cell Tether	FCT	Morado	2	200
Códigos de barras rápidos	RB01-96	-	3 placas	8 µl por pocillo

Este producto contiene el reactivo AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter, Inc. y puede almacenarse a -20 °C con el kit sin que ello afecte a la estabilidad del reactivo.

Hemos desarrollado cuatro métodos de extracción optimizados para generar ADN genómico de gran calidad a partir de sus cultivos celulares, lo que permite maximizar el rendimiento de la secuenciación utilizando este método.

¿Qué método de extracción es el adecuado para mí?

Método de extracción de muestras	Tipo de muestra	Muestra inicial	Rendimiento esperado	Número de integridad del ADN (DIN) esperado	Longitud media de lecturas de secuenciación	Kits de extracción utilizados
Extracción general de ADN genómico mediante homogeneización con microesferas	Aplicaciones generales: bacterias, hongos o levaduras	1 ml de cultivo líquido incubado durante la noche (~1 × 10⁸–10⁹ UFC/ml) o la mitad de un asa de colonias de una placa	>200 ng/µl por muestra	7-9	~4-7 kb	QIAGEN PowerBead Tube y Promega Maxwell® RSC PureFood Pathogen kit
Extracción de ADNg bacteriano	Bacteriano	200 µl de cultivo líquido incubado durante la noche (~1 × 10⁸–10⁹ UFC/ml) o 1/8 de un asa de siembra de una placa	~15-20 ng/µl por muestra	9	>7 kb - El tamaño variará en función de la especie de la cantidad de muestra inicial	Kit de extracción de ADNg genómico NEB Monarch Spin
Extracción de ADNg de organismos difíciles de lisar	Mycobacterium tuberculosis (o muestras bacterianas difíciles de extraer)	5-10 mg de células de medios sólidos o líquidos	~15-40 ng/µl por muestra	8	>7 kb: el tamaño variará en función de la especie de la muestra inicial	Kit NEB Monarch Spin gDNA Extraction

Nota: El rendimiento, el DIN y la longitud de lectura de secuenciación del ADN extraído pueden variar en función de la calidad de la muestra y la especie. Siga el método correcto y utilice muestras de buena calidad.

Siga los enlaces de la tabla anterior, donde se encuentra la documentación de los métodos de extracción.
También puede encontrar estos métodos de extracción en la pestaña Protocolos de extracción Documentación de la comunidad Nanopore.

Este método se ha desarrollado para procesar simultáneamente 24 muestras con un tamaño de genoma de hasta 7 Mb.

En muestras con un genoma de mayor tamaño (>7 Mb), recomendamos reducir a 8 el número de muestras que se etiqueten con códigos de barras y se secuencien simultáneamente.

A fin de obtener un resultado óptimo, en la actualidad no recomendamos utilizar menos de 4 códigos de barras.

Nota: este método ofrece un proceso estandarizado de procesamiento de muestras que hemos validado internamente. Estos ajustes son aplicables a la mayoría de aplicaciones y recomendamos a los usuarios nuevos que sigan el método recomendado. Los usuarios con experiencia pueden ajustar el rendimiento de las muestras (de 4 a 48 muestras con códigos de barras) en función de la calidad de las muestras, el tamaño del genoma y los requisitos de cobertura.

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Compruebe que MinKNOW esté instalado en su ordenador o dispositivo. Encontrará más instrucciones para configurar un experimento de secuenciación en el protocolo MinKNOW.

Recomendamos configurar un experimento en un MinION o GridION, siguiendo las recomendaciones de identificación de bases y adición de códigos descritas a continuación. El resto de parámetros se pueden dejar con su configuración predeterminada.

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Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Acceder a la página inicial y seleccionar Iniciar la secuenciación.
2. Introducir los datos del experimento: nombre, posición de la celda de flujo e identificador de la muestra.
3. En la página Kits, seleccionar Rapid Barcoding Kit 24 (SQK-RBK114-24) o Rapid Barcoding Kit 96 (SQK-RBK114-96).
4. Mantener las opciones predeterminadas: duración de 72 horas y longitud mínima de lectura de 200 bp.
5. Configurar la identificación de bases y la asignación de códigos con estos parámetros:

• Activar la identificación de bases.
• En “Modelos”, pulsar Editar y seleccionar Identificación de bases de gran precisión (HAC) en el menú desplegable.
• Activar la asignación de códigos.
• Mantener el resto de opciones en sus valores predeterminados.
• Pulsar Continuar.

6. Definir el formato de salida y filtrar con los siguientes ajustes:

• Seleccionar .POD5 como formato de salida.
• Verificar que .FASTQ figure como formato de lecturas identificadas.
• Activar el filtrado.
• Seleccionar Continuar.

7. En la página de revisión, al pulsar Inicio comenzará la secuenciación.

Recomendamos realizar el análisis con EPI2ME, ya que facilita el análisis bioinformático y permite a los usuarios realizar flujos de trabajo Nextflow en una aplicación de escritorio. EPI2ME contiene una colección de flujos de trabajo bioinformáticos, seleccionados y gestionados prontamente por expertos en análisis de secuencias de lecturas largas.

Aquí encontrará más información sobre los flujos de trabajo disponibles en EPI2ME, junto con la Guía de inicio rápido, útiles para abordar el primer flujo de trabajo bioinformático.

A fin de obtener un ensamblaje y una alineación precisos y fiables de genomas de aislamientos bacterianos o fúngicos generados con los protocolos incluidos, recomendamos utilizar el flujo de trabajo wf-bacterial-genomes. En esencia, el flujo de trabajo es un flujo bioinformático de ensamblaje eficiente que también pule los genomas con Medaka.

Aunque ejecutar el flujo de trabajo con los parámetros predeterminados producirá ensamblajes genómicos de gran calidad, el modo «Isolates» realizará análisis adicionales diseñados para aumentar la calidad del genoma y facilitar su interpretación en patógenos comunes en los ámbitos clínico y de seguridad alimentaria. Los análisis del modo Isolates incluyen MLST (7 genes), confirmación de especies y predicción de resistencia a los antimicrobianos, además de informes específicos de las muestras.

Nota: también es posible ejecutar este flujo de trabajo desde la línea de comandos. Pero, solo recomendamos esta opción a usuarios experimentados. Encontrará más información, en la página wf-bacterial-genomes de GitHub.

También disponemos de una sección de Preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

También disponemos de una sección de Preguntas frecuentes (FAQ), en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.