Direct-from-colony microbial sequencing: rapid Salmonella serotyping (SQK-RPB114.24)
MinION: Protocol
Direct-from-colony microbial sequencing: rapid Salmonella serotyping (SQK-RPB114.24) V DCM_9210_V114_revB_30Sep2024
This protocol:
- is a rapid method to perform sequencing and analysis of Salmonella.
- uses Salmonella colonies from overnight cultures.
- includes tagmentation, barcoding and PCR amplification.
- enables multiplexing of 1-24 samples.
- is compatible with R10.4.1 flow cells.
For Research Use Only
This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
Sequencing and data analysis
- 5. Data acquisition and basecalling
- 6. Downstream analysis
- 7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Troubleshooting
Descripción general
This protocol:
- is a rapid method to perform sequencing and analysis of Salmonella.
- uses Salmonella colonies from overnight cultures.
- includes tagmentation, barcoding and PCR amplification.
- enables multiplexing of 1-24 samples.
- is compatible with R10.4.1 flow cells.
For Research Use Only
This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
1. Overview of the protocol
IMPORTANTE
Este es un producto de acceso anticipado
Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de productos.
Procure usar siempre la versión más reciente del protocolo.
Introduction to the direct-from-colony microbial sequencing: rapid Salmonella serotyping protocol
This protocol describes a method for preparing, sequencing and analysis of up to 24 Salmonella colonies using the Rapid RCR Barcoding Kit V14 (SQK-RPB114.24).
This simple end-to-end solution allows you to generate whole genome sequencing data directly from a single Salmonella colony, eliminating the need for subculture into liquid broth, DNA extraction or complex library preparation methods, thereby offering faster tun-around times.
Combined with our custom wf-bacterial-genomes analysis pipeline using EPI2ME, this method provides an organism species ID, serotype, multi locus sequence type (MLST) and antibiotic resistance (AMR) profile information.
This method is designed to provide non-circular genomes for research and routine lab operations, including food safety testing purposes.
For more information and additional options for this end-to-end workflow please visit our know-how document.
Steps in the end-to-end workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Ensure pathogenic organisms are handled in appropriate biosafety conditions. Please adhere to the correct health and safety practices in accordance to your laboratory standards and local rules and regulations.
This method should be performed in the appropriate containment level laboratory spaces (biosafety cabinets: BSC) until the sample tagmentation stage. Following sample tagmentation, cells are non-viable and can be used outside the biosafety cabinet. - Streak your sample onto a freshly prepared agar plate appropriately such that single Salmonella colonies can be isolated (overnight). We recommend the use of TSA plates for culturing Salmonella.
The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run
Library preparation
The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and optional stopping points.
| Step | Process | Time | Stop option |
|---|---|---|---|
| Colony growth | Grow Salmonella single colony culture(s) of ~2-3 mm overnight on an agar plate. | ~16-18 hours | |
| Sample preparation | Resuspend each single colony in Tris Buffer. | 5 minutes | |
| DNA tagmentation | Tagment your DNA using the Fragmentation Mix from the sequencing kit | 10 minutes | |
| PCR amplification | PCR your sample using the barcoded primer supplied in the sequencing kit | 180 minutes | We do not recommend leaving the PCR reaction overnight, using the amplified samples straight after PCR will yield better results. If sample storage is unavoidable, add 4 uL EDTA to each sample and then stored at 4°C. |
| Sample pooling and cleanup | Pool your barcoded PCR samples in equal ratios and perform a clean-up | 30 minutes | 4°C overnight |
| Adapter ligation and clean-up | Attach the sequencing adapters to the DNA ends | 5 minutes | We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted. |
| Priming and loading the flow cell | Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing | 5 minutes |
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
- Start the EPI2ME software and select the wf-bacterial-genomes workflow
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
- R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Flow Cell Priming Kit V14 (EXP-FLP004)
- MinION Mk1B - MinION Mk1B IT requirements document
- GridION - GridION IT requirements document
2. Equipment and consumables
Material
- Up to 24x single Salmonella colonies (2–3 mm in diameter)
- Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- 1 M Tris Buffer, pH8 (e.g. Invitrogen™, AM9855G)
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Inoculation loop or equivalent for picking your colony
- Cubeta con hielo
- Microcentrífuga
- Temporizador
- Termociclador
- Gradilla magnética
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- P2 pipette and tips
- Multichannel pipette and tips
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
- Bioanalizador Agilent (o equivalente)
- Microbiological Safety Cabinet II contamination level 3
For this protocol, you will need a single colony of Salmonella 2–3 mm in diameter for each input.
Streak your sample onto a freshly prepared agar plate appropriately such that single Salmonella colonies can be isolated (overnight). We recommend the use of TSA plates for culturing Salmonella.
Optional: Alternatively, you can use 3-5 ng in 3 μl volume per sample of isolated DNA as input for library preparation.
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
IMPORTANTE
The Rapid Adapter (RA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.
Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) contents
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (µl) |
|---|---|---|---|---|
| Fragmentation Mix | FRM | Brown | 1 | 160 |
| Rapid Adapter | RA | Green | 1 | 15 |
| Adapter Buffer | ADB | Clear | 1 | 100 |
| AMPure XP Beads | AXP | Amber | 3 | 1,200 |
| Elution Buffer | EB | Black | 2 | 500 |
| EDTA | EDTA | Blue | 1 | 700 |
| Sequencing Buffer | SB | Red | 1 | 700 |
| Library Beads | LIB | Pink | 1 | 600 |
| Library Solution | LS | White cap, pink label | 1 | 600 |
| Flow Cell Flush | FCF | Clear | 1 | 8,000 |
| Flow Cell Tether | FCT | Purple | 1 | 200 |
| Rapid Barcode Primer 01-24 | RLB01-24 | Clear | 24 (one per barcode) | 15 |
Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.
Rapid barcode primers
| Component | Sequence |
|---|---|
| RLB01 | AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG |
| RLB02 | TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT |
| RLB03 | GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG |
| RLB04 | TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA |
| RLB05 | CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT |
| RLB06 | TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC |
| RLB07 | GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT |
| RLB08 | TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT |
| RLB09 | AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT |
| RLB10 | AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC |
| RLB11 | GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA |
| RLB12 | GTTGAGTTACAAAGCACCGATCAG |
| RLB13 | AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA |
| RLB14 | AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA |
| RLB15 | AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG |
| RLB16 | CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT |
| RLB17 | ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT |
| RLB18 | CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC |
| RLB19 | GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT |
| RLB20 | TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT |
| RLB21 | GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA |
| RLB22 | ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG |
| RLB23 | CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG |
| RLB24 | GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG |
3. Library preparation
Material
- Up to 24x single Salmonella colonies (2–3 mm in diameter)
- Fragmentation Mix (FRM)
- Rapid Barcode Primers (RLB01-24, at 10 µM)
- EDTA (EDTA)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB)
- Rapid Adapter (RA)
- Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
- 1 M Tris Buffer, pH8 (e.g. Invitrogen™, AM9855G)
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Inoculation loop or equivalent for picking your colony
- Cubeta con hielo
- Termociclador
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Gradilla magnética
- Microcentrífuga
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Equipo opcional
- Microbiological Safety Cabinet II contamination level 3
ATENCIÓN
Ensure pathogenic organisms and samples are handled in appropriate biosafety conditions.
Please adhere to the correct health and safety practices in accordance to your laboratory standards and local rules and regulations.
This method should be performed in the appropriate containment level laboratory spaces (biosafety cabinets: BSC) until the sample tagmentation stage. Following sample tagmentation, cells are non-viable and can be used outside the biosafety cabinet.
Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting or vortexing |
|---|---|---|---|
| Rapid Barcode Primers (RLB01-24) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Fragmentation Mix (FRM) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Rapid Adapter (RA) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Adapter Buffer (ADB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| AMPure XP Beads (AXP) | ✓ | ✓ | Mix by pipetting or vortexing immediately before use |
| Elution Buffer (EB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| EDTA (EDTA) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
Note: Once thawed, keep all kit components on ice.
IMPORTANTE
When picking a single colony, please ensure that no media is carried through as this can negatively impact the PCR yields.
Prepare each cultured cell colony as follows:
- For each colony/sample, add 50 µl 10 mM tris buffer (pH 8) to a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
- Using an inoculation loop, transfer a single 2–3 mm colony from an overnight culture into a separate tube (from the step above).
- Resuspend each colony thoroughly by pipette mixing and briefly vortexing.
- Ensure your cell colony suspension is homogenous before proceeding.
In a separate 0.2 ml thin-walled PCR tube for each sample, mix the following:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| DNA/colony suspension (from previous step) | 3 μl |
| Fragmentation Mix (FRM) | 1 μl |
| Total | 4 μl |
Mix thoroughly by pipetting the reaction.
In a thermal cycler, incubate the tube at 30°C for 2 minutes, then at 80°C for 2 minutes.
Sample tagmentation has taken place, cells are now non-viable and can be used outside the biosafety cabinet.
Please continue to adhere to the correct health and safety practices in accordance to your laboratory standards and local rules and regulations.
For each sample, set up a PCR reaction as follows in the 0.2 ml thin-walled PCR tube containing the tagmented DNA:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Tagmented DNA (from previous step) | 4 µl |
| Nuclease-free water | 20 µl |
| RLB (01-24, at 10 µM) | 1 µl |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | 25 µl |
| Total | 50 µl |
If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Amplify using the following cycling conditions:
| Cycle step | Temperature | Time | No. of cycles |
|---|---|---|---|
| Initial denaturation | 95°C | 3 mins | 1 |
| Denaturation Annealing Extension | 95°C 56°C 65°C | 15 sec 15 sec 6 min | 25* |
| Final extension | 65°C | 6 min | 1 |
| Hold | 4°C | ∞ |
For more information on the PCR cycle number and externsion times please visit our know-how document.
Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.
CONSEJO
EDTA is added at this step to stop the reaction.
Incubate for 5 minutes at room temperature.
Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.
Note: The expected PCR yield for each sample is 15–45 ng/µl.
Pool 100 ng of each PCR barcoded samples in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward 100 ng of each of the samples for optimal barcode balancing.
Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.
Make up the volume of pooled samples to the nearest 100 µl using nuclease free water.
For example:
- if the 100 ng pool of each sample results in a total of 88 µl, add 12 µl of nuclease-free water to make up the volume to 100 µl.
- if the 100 ng pool of each sample results in a total of 180 µl, add 20 µl of nuclease-free water to make up the volume to 200 µl.
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:
| Volume of barcoded sample pool | 100 μl | 200 μl | 300 μl |
|---|---|---|---|
| Volume of AMPure XP Beads (AXP) | 60 μl | 120 μl | 180 μl |
Incubate the reaction on a hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.
Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
- Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
- Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.
Transfer 250 ng of your eluted samples into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).
Note: If your final yield is below 250 ng, take forward 11 µl of eluted sample for the maxium flow cell loading amount possible.
Please note, if you underload the flow cell you might need to sequence for longer than stated in this method to achieve the recommended number of reads (at least 50k reads per barcode).
In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | 1.5 μl |
| Adapter Buffer (ADB) | 3.5 μl |
| Total | 5 μl |
Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.
FIN DEL PROCESO
The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.
4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell
Material
- Flow Cell Flush (FCF)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo. (1)
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:
| Reagents | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Final total volume in tube | 1,205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera: (1)
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
5. Data acquisition and basecalling
Cómo empezar a secuenciar (1)
El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:
1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.
Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".
2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.
Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.
3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.
Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.
4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.
Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.
5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.
Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.
MinKNOW settings for Salmonella serotyping
For fastest turnaround time and easiest analysis, basecalling should be performed live during the sequencing run using the High Accuracy (HAC) basecaller.
Below are the recommendations for MinKNOW settings:
Positions
Flow cell position: [user defined]
Experiment name: [user defined]
Flow cell type: FLO-MIN114
Sample ID: [user defined]
Kit
Kit selection: Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB114.24)
Run configuration
Sequencing and analysis
Basecalling: On [default] Modified bases: Off Model: High-accuracy basecalling (HAC) [default]
Barcoding: On [default] Trim barcodes: Off [default] Barcode both ends: Off [default] Custom barcodes selection: Off [default]
Alignment: Off [default]
Adaptive sampling: Off [default]
Advanced options Active channel selection: On [default] Time between pore scans: 1.5 [default] Reserve pores: On [default]
Data targets
Sequencing time will vary according to the number of samples being sequenced. The aim is to generate 50k reads per sample/barcode.
Run limit: Set according to number of sampeles:
| Number of samples/barcodes | Recommended sequencing time |
|---|---|
| 6 | 4 hours |
| 12 | 8 hours |
| 24 | 12 hours |
Output
Output format .POD5: On [default] .FASTQ: On [default] .BAM: On
Filtering: On [default] Qscore: 9 [default] Minimum read length: 200 bp [default]
6. Downstream analysis
Post-basecalling analysis
We recommend performing downstream analysis using EPI2ME which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a desktop application. EPI2ME maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis.
Further information about the available EPI2ME workflows are available here, along with the Quick Start Guide to start your first bioinformatic workflow.
For the accurate and reliable assembly or alignment of you sample genomes, we recommend using the wf-bacterial-genomes workflow. At its core, the workflow is an efficient assembly pipeline which also polishes genomes using Medaka.
Whilst running the workflow using the default parameters will , using the ‘Isolates’ mode to produce high quality genome assemblies, perform additional analyses designed to increase genome quality and aid genome interrogation for common pathogens in the clinical and food safety fields. ‘Isolates’ analyses includes MLST(7-gene), species confirmation and AMR prediction in addition to sample-specific reports.
Note: You can also run this workflow through command line. However, we only recommend this option for experienced users. For more information, please visit the wf-bacterial-genomes page on GitHub and the know-how document.
IMPORTANTE
Please ensure your device meets the minimum compute requirements to run this workflow.
Compute requirements:
| CPUs | Memory | |
|---|---|---|
| Minimum requirements: | 8 | 32GB |
| Recommended requirements: | 16 | 64GB |
For more information visit the EPI2ME wf-bacterial-genomes documentation.
Open the EPI2ME app using the desktop shortcut.
On the landing page, open the workflow tab on the left-hand sidebar.
Navigate to the Available workflows tab and click on wf-bacterial-genomes option.
Click install.
Navigate to the Installed tab and click on the installed wf-bacterial-genomes workflow.
MEDIDA OPCIONAL
If the workflow was already installed, check for updates by clicking 'Update workflow'.
Ensure you are using v1.3.0 or newer of the workflow. We recommend running the latest version of our workflows for the best results.
Click on Run this workflow to open the launch wizard.
Set up your run by uploading your FASTQ file in the Input Options. We recommend keeping the default settings for the other parameter options.
In Sample Options, provide a sample sheet to match sample folder names (e.g. barcode01) to a sample name alias to be used in output reports.
You may specify any number of sample (barcode) folders in your sample sheet.
To enable the isolates mode, tick the isolates checkbox.
In Advanced Options unselect Prokka annotation.
Optional setting: Set Flye genome size to 5000000, and Flye asm coverage to 50 (these settings are optional but will speed up run time).
MEDIDA OPCIONAL
In Miscellaneous Options, set number of CPU threads.
Navigate to the 'Nextflow configuration' tab to assign a 'Run name' to your analysis as an identifier.
Click Launch workflow.
Ensure all parameter options have green ticks.
Once the workflow finishes, a report will be produced.
MEDIDA OPCIONAL
Test data is available on Github to test the wf-bacterial-genomes workflow.
The test data can be found in the following repository: wf-bacterial-genomes test data
7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
8. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Low DNA recovery after AMPure bead clean-up
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Low recovery | DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio | 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample. 2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up. |
| Low recovery | DNA fragments are shorter than expected | The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use.  |
| Low recovery after end-prep | The wash step used ethanol <80% | DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage. |
9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA | Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 9/30/2024
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