本实验指南详细描述了使用免扩增条形码测序试剂盒-96 V14（SQK-NBD114.96）为基因组DNA（gDNA）样品进行免扩增添加条码建库测序的操作流程及常见问题的解决方法。试剂盒内含96种不同的条形码，可实现多达96个不同样本的混样测序。为使您尽快熟悉操作流程，我们强烈建议您在使用样品测序前，先使用Lambda标准品完成标准对照实验。

测序工作流程：

准备您的实验

您将需要：

• 提取DNA，并评估DNA的长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。
• 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
• 下载数据收集和分析软件。
• 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

文库制备

您将需要：

• 修复DNA，并对DNA进行末端修复以便与接头连接。
• 将试剂盒中提供的免扩增条码连接到DNA末端。
• 将试剂盒中提供的测序接头连接到DNA末端。
• 对测序芯片进行预处理，将DNA文库加至芯片。

测序和分析

您将需要：

• 使用MinKNOW软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
• 通过MinKNOW或Guppy碱基识别进行条形码拆分，选择“SQK-NBD114.96 试剂盒”选项。
• 使用EPI2ME软件，选择所需工作流程进行进一步分析（此步骤非必需）。

DNA质控

选择符合质量和浓度要求的起始DNA至关重要的。使用过少或过多的DNA，或者质量较差的DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物的DNA）都会影响文库制备。

有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控实验指南 。

化学污染物

从原始样本中提取DNA的方法不同，可能会导致经纯化的DNA中所残留的化学污染物不同。这会影响文库的制备效率和测序质量。请在牛津纳米孔社区的 Contaminants（污染物）页面 了解更多信息。

Oxford Nanopore Technologies推荐您使用本实验指南中提及的所有第三方试剂，并已对其加以验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂.

请注意： 我们正在将部分试剂的包装形式由单次管装改为瓶装，并减低EDTA的浓度。

管装试剂及高浓度装EDTA：

† 较高浓度装EDTA的管盖为透明色。

瓶装试剂并减低EDTA浓度：

‡ 较低浓度装EDTA的管盖为蓝色。

请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20℃下储存（试剂稳定性将不受损害）。

条形码孔板中的条形码是按照列进行排序的。

请注意： DNA参照（DCS）是一段可比对到Lambda基因组的3'端、长度为3.6 kb 的标准扩增子。

上述扩展包旨在提供额外的建库及测序芯片预处理试剂，方便用户使用条形码测序试剂盒中剩余的少部分条形码运行测序实验。

当联用时，两扩展包内试剂可满足12次反应。如果您在此过程中需要额外的 EDTA，我们建议使用浓度为0.25M的EDTA。如果您使用不超过24种条码进行建库，则建议为每个样本添加4 µl的EDTA；如果使用25至96种条码进行建库，则建议添加2 µl。

免扩增条形码扩展包（EXP-NBA114）内容物：

请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20℃储存（试剂稳定性将不受损害）。

测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）内容物：

MinION Mk1C是一款集计算功能和触控屏幕于一体的便携式测序分析仪，它无需依赖任何额外设备，即可生成并分析纳米孔测序数据。您可以在 MinION Mk1C的IT配置要求文件中了解更多。

请为MinION Mk1B配备一台高规格的计算机或笔记本电脑，以适配数据采集的速度。您可以在MinION Mk1B的IT配置要求文件中了解更多。

MinKNOW

MinKNOW软件负责控制纳米孔测序仪、实时收集测序数据并进行碱基识别。您将在每次测序实验中使用MinKNOW。MinKNOW还可以通过条形码标记序列，并在测序完成后对数据进行碱基/序列识别及拆分。

有关如何运行MinKNOW软件的说明，请参考 MinKNOW实验指南中的相关部分。

EPI2ME （可选）

EPI2ME云端平台为下机数据提供进一步的分析（如，与Lambda基因组比对、条形码拆分、或分类学鉴定）。EPI2ME 仅 在您需要对下机数据进一步分析时使用。

有关如何创建EPI2ME账户并安装EPI2ME桌面代理（EPI2ME Desktop Agent）的说明，请参考EPI2ME平台使用指南。

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

对大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）给测序芯片上样。然而，对于粘稠的文库，借助文库颗粒上样可能会比较困难，此时使用文库溶液（LIS）可能更为合适。

在完成测序芯片的加样后，您即可在MinKNOW中启动测序实验。MinKNOW 软件负责仪器控制、数据采集以及实时碱基识别。有关设置和使用 MinKNOW 的详细信息，请参阅MinKNOW 实验指南。

您可以通过多种方式使用并设置MinKNOW：

• 在直接或远程连接到测序设备的计算机上。
• 直接在 GridION、MinION Mk1C 或 PromethION 24/48 测序设备上。

有关在测序设备上使用 MinKNOW 的更多信息，请参阅相应设备的用户手册：

• MinION Mk1B 用户手册
• MinION Mk1C 用户手册
• GridION 用户手册

在MinKNOW中启动测序：

1. 在 "开始 "（Start）页面上，选择 __开始测序__（Start Sequencing)。

2. 输入实验详情：例如实验名称，测序芯片位置及样本ID。

3. 在"试剂盒"页面上，选择建库试剂盒。

4. 配置测序实验参数，或保持“运行选项”和“分析”页面中的默认设置。

请注意： 如果在设置运行参数时关闭了碱基识别，您可在实验结束后，在MinKNOW中运行线下碱基识别。详情请参阅MinKNOW实验指南。

5. 在“输出”页面中，设置输出参数或保持默认设置。

6. 单击 "参数确认" 页面上的 开始 启动测序。

Kit 14试剂改善了双链碱基识别方面的表现。如使用 Dorado 进行双链碱基识别，用户需首先在MinKNOW上进行单链碱基识别，然后再于Dorado上重新进行碱基识别，获得双链序列数据。

有关如何设置测序实验以进行单链和双链碱基识别的详细信息，请查阅 Kit 14 测序和互补双链碱基识别 技术指南。

请注意： 当在Dorado上运行碱基识别时，我们建议您停止其他碱基识别操作，以最大化Dorado的可用内存，获得最佳性能。一旦Dorado在MinKNOW GUI上的运行结束，您可以重新启动其他操作。

当于MinKNOW上完成测序后，您可按照“测序芯片的重复利用及回收”一节中的说明重复使用或返还测序芯片。

完成测序和碱基识别后，即可进行数据分析。有关碱基识别和后续分析选项的详细信息，请参阅数据分析文档。

在下游分析部分，我们将概述更多用于数据分析的选项。

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

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