Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) V RPB_9191_v114_revD_16Oct2024

This protocol:

  • uses genomic DNA
  • has a low input requirement
  • method involves tagmentation, barcoding and PCR amplification
  • allows multiplexing of 1–24 samples
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

This protocol:

  • uses genomic DNA
  • has a low input requirement
  • method involves tagmentation, barcoding and PCR amplification
  • allows multiplexing of 1–24 samples
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Document version: RPB_9191_v114_revD_16Oct2024

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

Este es un producto de acceso anticipado

Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de productos.

Procure usar siempre la versión más reciente del protocolo.

Introduction to the Rapid PCR Barcoding 24 V14 protocol

This protocol describes how to carry out rapid low input PCR barcoding of genomic DNA using the Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24). There are 24 unique barcodes, allowing the user to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity.

The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.

  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

  • Tagment your DNA using the Fragmentation Mix in the kit
  • PCR using the barcoded primer supplied in the kit
  • Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Note that after the PCR, the average length of DNA fragments should be <5 kb.

RPB114 workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow
IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

Material
  • 1–5 ng high molecular weight genomic DNA
  • Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Cubeta con hielo
  • Microcentrífuga
  • Temporizador
  • Termociclador
  • Gradilla magnética
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Pipeta y puntas P1000
  • P200 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • P2 pipette and tips
  • Multichannel pipette and tips
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)

For this protocol, you will need 1-5 ng high molecular weight genomic DNA.

Note: Your input DNA must be at least 4 kb in length to ensure correct tagmentation and PCR amplification.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000
IMPORTANTE

The Rapid Adapter (RA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) contents

sqk-rpb114.24 tubes

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Fragmentation Mix FRM Brown 1 160
Rapid Adapter RA Green 1 15
Adapter Buffer ADB Clear 1 100
AMPure XP Beads AXP Amber 3 1,200
Elution Buffer EB Black 2 500
EDTA EDTA Blue 1 700
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LS White cap, pink label 1 600
Flow Cell Flush FCF Clear 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Rapid Barcode Primer 01-24 RLB01-24 Clear 24 (one per barcode) 15

Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Rapid barcode primers

Component Sequence
RLB01 AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
RLB02 TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
RLB03 GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
RLB04 TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
RLB05 CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
RLB06 TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
RLB07 GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
RLB08 TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
RLB09 AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
RLB10 AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
RLB11 GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
RLB12 GTTGAGTTACAAAGCACCGATCAG
RLB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA
RLB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA
RLB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG
RLB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT
RLB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT
RLB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC
RLB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT
RLB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT
RLB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA
RLB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG
RLB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG
RLB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG

3. Library preparation

Material
  • 1–5 ng high molecular weight genomic DNA
  • Fragmentation Mix (FRM)
  • Rapid Barcode Primers (RLB01-24, at 10 µM)
  • EDTA (EDTA)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • Elution Buffer (EB)
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Cubeta con hielo
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Pipeta y puntas P1000
  • P200 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2

Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting or vortexing
Rapid Barcode Primers (RLB01-24) Not frozen ✓ Pipette
Fragmentation Mix (FRM) Not frozen ✓ Pipette
Rapid Adapter (RA) Not frozen ✓ Pipette
Adapter Buffer (ADB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
AMPure XP Beads (AXP) ✓ ✓ Mix by pipetting or vortexing immediately before use
Elution Buffer (EB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
EDTA (EDTA) ✓ ✓ Vortex or Pipette

Note: Once thawed, keep all kit components on ice.

IMPORTANTE

Your input DNA must be at least 4 kb in length to ensure correct tagmentation and PCR amplification.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 1–5 ng of each genomic DNA sample into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Adjust the volume to 3 μl with nuclease-free water
  • Mix thoroughly by flicking avoiding unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
1-5 ng template DNA 3 μl
Fragmentation Mix (FRM) 1 μl
Total 4 μl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

In a thermal cycler, incubate the tube at 30°C for 2 minutes and then at 80°C for 2 minutes. Briefly put the tube on ice to cool it down.

For each sample, set up a PCR reaction as follows in a 0.2 ml thin-walled PCR tube:

Reagent Volume
Tagmented DNA (from previous step) 4 µl
Nuclease-free water 20 µl
RLB (01-24, at 10 µM) 1 µl
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix 25 µl
Total 50 µl

If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 95°C 3 mins 1
Denaturation

Annealing

Extension		 95°C

56°C

65°C		 15 sec

15 sec

6 min
14*
Final extension 65°C 6 min 1
Hold 4°C ∞

*We recommend 14 cycles as a starting point. However, the number of cycles can be adjusted up to 25 cycles according to experimental needs.

Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.

CONSEJO

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Incubate for 5 minutes at room temperature.

Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.

CONSEJO

We recommend pooling samples in an equimolar ratio to a final combined concentration of 200–400 fmol (~400–800 ng) for optimum barcode balance during sequencing.

If users want to to perform multiple flow cell loads from their library preparation, we recommend pooling in the higher concentration range.

Pool all barcoded samples in equimolar ratios to a combined final concentration of 200–400 fmol (~400–800 ng) in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

For a 200 fmol final pool:

Number of barcoded samples pooled 2 samples 6 samples 12 samples 24 samples
Concentration of each barcoded sample added to the pool 100 fmol
(~200 ng)		 33.3 fmol
(~66.7 ng)		 16.7 fmol
(~33.3 ng)		 8.3 fmol
(~16.7 ng)
Final pool concentration 200 fmol
(~400 ng)		 200 fmol
(~400 ng)		 200 fmol
(~400 ng)		 200 fmol
(~400 ng)

For a 300 fmol final pool:

Number of barcoded samples pooled 2 samples 6 samples 12 samples 24 samples
Concentration of each barcoded sample added to the pool 150 fmol
(~300 ng)		 50 fmol
(~100 ng)		 25 fmol
(~50 ng)		 12.5 fmol
(~25 ng)
Final pool concentration 300 fmol
(~600 ng)		 300 fmol
(~600 ng)		 300 fmol
(~600 ng)		 300 fmol
(~600 ng)

For a 400 fmol final pool:

Number of barcoded samples pooled 2 samples 6 samples 12 samples 24 samples
Concentration of each barcoded sample added to the pool 200 fmol
(~400 ng)		 66.7 fmol
(~133.3 ng)		 33.3 fmol
(~66.7 ng)		 16.7 fmol
(~33.3 ng)
Final pool concentration 400 fmol
(~800 ng)		 400 fmol
(~800 ng)		 400 fmol
(~800 ng)		 400 fmol
(~800 ng)

Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward an equimolar concentration of each of the samples for optimal barcode balancing. Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:

Volume of barcoded sample pool 37.5 μl 75 μl 150 μl 300 μl 600 μl
Volume of AMPure XP Beads (AXP) 22.5 μl 45 μl 90 μl 180 μl 360 μl

Note: Table contains example volumes for reference. Please adjust the volume of AMPure XP Beads (AXP) added for the volume of your barcoded sample pool to ensure a 0.6X volume ratio.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Transfer 10–50 fmol of your eluted samples into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagent Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 μl
Total 5 μl

Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

FIN DEL PROCESO

The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

Material
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Uso de Library Solution (LIS)

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:

Reagents Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Final total volume in tube 1,205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

5. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

Cómo empezar a secuenciar

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:

1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".

2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.

3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.

4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.

Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.

5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.

6. Análisis

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:

1. Procesos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

8. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Low DNA recovery after AMPure bead clean-up

Observation Possible cause Comments and actions
Low recovery DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample.

2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up.
Low recovery DNA fragments are shorter than expected The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use. SPRI cleanup
Low recovery after end-prep The wash step used ethanol <80% DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage.

9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 10/16/2024

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