Secuenciación rápida de ADN - Kit de 24 códigos para 16S V14 (SQK- 16S114.24)

Oxford Nanopore Technologies
Document type icon

MinION: Protocol

Secuenciación rápida de ADN - Kit de 24 códigos para 16S V14 (SQK- 16S114.24) V 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

Un protocolo capaz de amplificar el gen 16S de ARN recombinante a partir del ADNg extraído.

  • Identificación bacteriana a nivel de género
  • Multiplexación de hasta 24 muestras diferentes
  • Compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1

Para uso exclusivo en investigación

Este protocolo es una traducción del protocolo inglés, versión E, actualizado el 11 de diciembre de 2024.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

Un protocolo capaz de amplificar el gen 16S de ARN recombinante a partir del ADNg extraído.

  • Identificación bacteriana a nivel de género
  • Multiplexación de hasta 24 muestras diferentes
  • Compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1

Para uso exclusivo en investigación

Este protocolo es una traducción del protocolo inglés, versión E, actualizado el 11 de diciembre de 2024.

Document version: 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

1. Aspectos generales

Presentación del kit de 24 códigos para 16S V14 —16S Barcoding Kit 24 V14— (en adelante nombrado solo en inglés)

Este protocolo describe cómo llevar a cabo la adición de códigos con química rápida de amplicones 16S con el kit 16S Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24). Dada a la presencia tanto de variantes de regiones altamente conservadas (adecuadas para cebadores universales y señales filogenéticas) como de regiones altamente variables (diferentes en las especies), el gen 16S ARNr se utiliza a menudo para la identificación bacteriana basada en secuencias.

El kit 16S Barcoding Kit 24 V14 permite acceder a una secuenciación rápida del 16S como método de identificación de organismos. Al acotar a una región de interés específica, es posible ver todos los organismos de la muestra sin necesidad de secuenciar regiones innecesarias del genoma, lo que ágiliza la prueba y la hace más barata. Hay 24 códigos diferentes, que permiten agrupar hasta 24 muestras diferentes en un único experimento de secuenciación.

Tras la secuenciación, es posible realizar el análisis utilizando el flujo de trabajo 16S de EPI2ME, que permite clasificar amplicones 16S a partir de las muestras.

Pasos del proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

  • Extraer el ADNg, evaluar su longitud, cantidad y pureza, según el protocolo de control de calidad Input DNA/RNA QC. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
  • Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
  • Descargar el programa para obtener y analizar los datos
  • Comprobar que la celda de flujo tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la biblioteca

La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca.

Preparación de la biblioteca Proceso Tiempo Parada opcional
Amplificación por PCR de código 16S Amplificar el gen 16S utilizando los códigos suministrados en el kit 10 minutos + PCR 4 °C durante la noche
Agrupación de muestras codificadas y lavado de microesferas Cuantificar y agrupar las muestras codificadas y realizar un lavado de la biblioteca mediante microesferas 15 minutos Almacenamiento a corto plazo o durante un uso repetido a 4 °C, como la recarga de la celda de flujo.
Almacenamiento a largo plazo de un solo uso a -80 °C.
Ligación de los adaptadores Ligar los adaptadores de secuenciación rápida a los extremos de ADN 5 minutos Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores.
Acondicionar y cargar la celda de flujo Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN 5 minutos

Flujo de trabajo con códigos para 16S V14

Secuenciación y análisis

Pasos:

  • Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos brutos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
  • Opcional: Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar el flujo de trabajo 16S.
IMPORTANTE

Compatibilidad del protocolo

Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:

2. Material y consumibles

Material
  • 10 ng de ADN genómico de alto peso molecular
  • 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora de celdas de flujo MinION/GridION
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Pipeta multicanal y puntas de varios tamaños
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

En este protocolo, necesitará 10 ng de ADN genómico de alto peso molecular por código.

A fin de obtener los mejores resultados, recomendamos utilizar al menos 4 códigos. Si desea multiplexar menos de 4 muestras, procure dividir la(s) muestra(s) entre múltiples códigos, para que al menos se secuencien 4 códigos (por ejemplo, para 2 muestras, utilice cebadores 16S con códigos 01-02 para la muestra A y cebadores 16S con códigos 03-04 para la muestra B). Nótese, la cantidad de muestra requerida por código es de 10 ng de ADNg.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

Contenido del Kit de 24 códigos para 16S V14

SQK-16S114.24 Kit content

Nombre Sigla Tapón color Nº de viales Volumen (μl)
Cebadores 16S con códigos 01-24 1-24 - 2 placas, 3 sets de códigos por placa 15 μl por pocillo
Rapid Adapter RA Verde 1 15
Adapter Buffer ADB Transparente 1 100
AMPure XP Beads AXP (tapón) Transparente, (etiqueta) Verde azulada 1 6,000
Elution buffer EB Negro 1 1 500
EDTA EDTA Azul 1 700
Sequencing Buffer SB Rojo 1 700
Library Beads LIB Rosa 1 600
Library Solution LIS (tapón) Blanco, (etiqueta) Rosa 1 600
Flow Cell Flush FCF (tapón) Transparente, (etiqueta) Azul claro 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Violeta 1 200

Nota: Este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.

3. Preparación de la biblioteca

Material
  • 10 ng de ADN genómico de alto peso molecular
  • Códigos identificadores 16S en placa de 96 pocillos, con una solución de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en una concentración de 1 μM
  • EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • Termociclador
  • Microcentrífuga
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Pipeta multicanal y puntas de varios tamaños

Requisitos mínimos en el uso de cebadores con códigos 16S

A fin de obtener los mejores resultados, recomendamos utilizar al menos 4 códigos. Si desea multiplexar menos de 4 muestras, distribuya la(s) muestra(s) en varios códigos, para que se procesen un mínimo de 4:

  • Para procesar 1 muestra, utilice 4 códigos por muestra (por ejemplo, cebadores con códigos 16S 01-04, con 10 ng de muestra A por código identificador).
  • Para procesar 2 muestras, utilice dos códigos por muestra, (por ejemplo, cebadores con códigos 16S 01-02 para la muestra A y cebadores con códigos 16S 03-04 para la muestra B).
  • Para procesar 3 muestras, ejecute 2 muestras individualmente y una muestra repartida en dos códigos (por ejemplo, cebador con códigos 16S 01 y cebador con códigos 16S 02 para las muestras A y B respectivamente y los cebadores 16S 03-04 para la muestra C).

Nótese, la cantidad de muestra requerida por código es 10 ng de ADNg.

VERIFICACIÓN

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos verificar la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Tomar una placa de 96 pocillos con códigos 16S. Separar un grupo de códigos (1-24, o como se prefiera) de la placa y devolver el resto a su sitio.

Plano de la placa con códigos 16S:

16S barcode plate layout

IMPORTANTE

Las placas de 96 pocillos están diseñadas para romperse en una sola dirección. Sin embargo, es posible extraer una o varias tiras de ocho pocillos a la vez.

Descongelar los códigos deseados a temperatura ambiente.

Centrifugarlos brevemente en la microcentrífuga y comprobar que el líquido esté en el fondo de los tubos. Colocar en hielo.

Descongelar la mezcla de reacción LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix, centrifugar brevemente, mezclar bien con la pipeta y colocar en hielo.

Preparar el ADN en agua sin nucleasas.

  • Transferir 10 ng de cada muestra de ADN genómico en un tubos de PCR de pared fina (0,2 ml).
  • Ajustar el volumen a un total de 15 μl con agua sin nucleasas.
  • Dar suaves golpecitos en el tubo con el dedo hasta mezclar bien el contenido, para evitar cizalladuras indeseadas.
  • Centrifugar brevemente en la microcentrífuga

En cada tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contenga una muestra que vaya a ser analizada, preparar la siguiente mezcla:

Reactivo Volumen
10 ng de muestra inicial de ADN (del paso anterior) 15 μl
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix 25 μl
Total 40 μl

Nótese, si se cambia la cantidad de muestra inicial, tal vez sea necesario ajustar el número de ciclos de PCR, para obtener el mismo rendimiento.

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para que los ingredientes se mezclen completamente.

Con ayuda de puntas de pipeta nuevas, perforar con cuidado la superficie de aluminio de los códigos necesarios. Para evitar la contaminación cruzada, utilizar una punta nueva para cada código. Anotar qué números de código se utilizarán en cada muestra.

Con una pipeta multicanal, mezclar los códigos 16S con la pipeta 10 veces. Transferir 10 μl de cada código 16S en los respectivos tubos con muestras.

Mezclar meticulosamente el contenido de los tubos 10 veces con la pipeta y centrifugar brevemente.

Nota: mezclar despacio procurando no introducir burbujas de aire en las reacciones.

Amplificar utilizando las siguientes condiciones de ciclado:

Fase Temperatura Tiempo Nº de ciclos
Desnaturalización inicial 95 °C 1 min 1
Desnaturalización 95 °C 20 secs 25
Hibridación 55 °C 30 secs 25
Extensión 65 °C 2 mins 25
Extensión final 65 °C 5 mins 1
Mantener 4 °C ∞

Descongelar los componentes del kit a temperatura ambiente, centrifugar brevemente y mezclar con la pipeta, como se indica en la tabla a continuación:

Reactivo 1. Descongelar a temperatura ambiente 2. Centrifugar brevemente 3. Mezclar a fondo con la pipeta o en vórtex
Rapid Adapter (RA) No congelado ✓ Pipeta
Adapter Buffer (ADB) ✓ ✓ Vórtex o pipeta
AMPure XP Beads (AXP) ✓ ✓ Mezclar en vórtex justo antes de utilizarlo
Elution Buffer (EB) ✓ ✓ Vórtex o pipeta
EDTA (EDTA) ✓ ✓ Vórtex o pipeta

Nota: una vez descongelados, colocar todos los reactivos en hielo.

Añadir 4 μl de EDTA a cada muestra etiquetada con un código de barras, mezclar meticulosamente con la pipeta y centrifugar brevemente.

CONSEJO

En este paso se añade EDTA para parar la reacción.

Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Cuantificar 1 μl de cada muestra etiquetada utilizando un fluorímetro Qubit (o equivalente) para realizar el control de calidad.

Agrupar las muestras etiquetadas en proporciones equimolares en un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml.

Nota: antes de dar este paso, cuantifique las muestras y utilice una concentración equimolar de cada una de ellas, a fin de obtener un balance óptimo de códigos. Tras la PCR, la concentración de las muestras puede variar, por lo que el volumen de cada muestra etiquetada que se añada al conjunto será diferente.

Resuspender las microesferas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Añadir al conjunto de muestras, un volumen de microesferas resuspendidas AMPure XP Beads, que sea 0.6 veces su volumen y mezclar con la pipeta:

Volumen del conjunto de muestras etiquetadas 37,5 μl 75 μl 150 μl 300 μl 600 μl
Volumen de AMPure XP Beads (AXP) 22,5 μl 45 μl 90 μl 180 μl 360 μl

Nota: la tabla contiene volúmenes de ejemplo como referencia. Ajustar el volumen añadido de AMPure XP Beads (AXP) al volumen del conjunto de muestras etiquetadas para garantizar una relación de 0,6 veces.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 2 ml de etanol al 80 % con agua sin nucleasas.

Centrifugar brevemente la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Sin quitar el tubo del imán, retirar el sobrenadante con una pipeta.

Con el tubo en el imán, lavar las microesferas con 1 ml de etanol al 80 %, sin desplazar el precipitado. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el precipitado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el precipitado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

  • Extraer y colocar el eluido que contiene la biblioteca de ADN, en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.
  • Deshechar las microesferas precipitadas.
VERIFICACIÓN

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Transferir 50 fmol de muestra eluida a un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind. Añadir Elution Buffer (EB) hasta llegar a volumen total de 11 μl.

En un tubo nuevo Eppendorf DNA LoBind, diluir el adaptador como se indica a continuación y mezclar con la pipeta:

Reactivo Volumen
Rapid Adapter (RA) 1,5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3,5 μl
Total 5 μl

Añadir 1 μl de Rapid Adapter (RA) diluido al ADN etiquetado con códigos de barras.

Mezclar dando suaves golpes en el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.

Incubar la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo hasta el momento de cargar.

4. Acondicionar y cargar la celda de flujo MinION/GridION

Material
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora de celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Acondicionar y cargar la celda de flujo

Recomendamos a los usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Uso de Library Solution (LIS)

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. No obstante, podría ser difícil cargar bibliotecas viscosas con las microesferas y tal vez resulte más apropiado utilizar Library Solution (LIS).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, Flow Cell Tether (FCT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex. Centrifugar brevemente y poner en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA) en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de preparación de la celda de flujo.

Nota: No recomendamos utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Para preparar la mezcla de acondiciomiento con seroalbúmina bovina, combinar los siguientes reactivos en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind. Invertir el tubo varias veces y mezclar con la pipeta a temperatura ambiente:

Reactivos Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Seroalbúmina bovina (BSA) a 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1,205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Paso 1b- Diagramas carga de la celda de flujo ES

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verificar la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado la celda de flujo con anterioridad, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Deslizar la tapa del puerto de purgado en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer solución amortiguadora de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que la solución cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de purgado, comprobar si hay burbujas de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de solución amortiguadora para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de purgado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de solución amortiguadora entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de solución amortiguadora circulando desde el puerto de purgado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de mezcla de acondicionamiento por del puerto de purgado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar cinco minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar minuciosamente con la pipeta el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

El vial Library Beads (LIB) contiene microesferas en suspensión. Las microesferas sedimentan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación recomendamos utilizar Library Beads (LIB). El reactivo Library Solution (LIS) está disponible en caso de utilizar bibliotecas más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Terminar de acondicionar la celda de flujo:

  1. Levantar con suavidad la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de mezcla de acondicionamiento en el puerto de purgado (no en el puerto SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca suavemente con la pipeta, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto SpotON de la celda de flujo. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de purgado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Posar la pantalla protectora sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipular la celda de flujo con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

5. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o a distancia.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página principal y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de la muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. En la pestaña Configuración del experimento, ajustar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o mantener la configuración por defecto.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, es posible identificar las bases tras la ejecución en MinKNOW. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página Inicio, pulsar en la casilla Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de análisis disponible durante y tras la identificación de bases, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis, se describen otras opciones para analizar los datos.

6. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

7. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Recomendamos realizar el análisis utilizando EPI2ME, ya que facilita el análisis bioinformático permitiendo a los usuarios realizar flujos de trabajo Nextflow en una aplicación de escritorio. EPI2ME contiene una colección de flujos de trabajo bioinformáticos, seleccionados y gestionados prontamente por expertos en análisis de secuencias de lecturas largas.

Aquí encontrará más información sobre los flujos de trabajo disponibles en EPI2ME, junto con la Guía de inicio rápido, útiles para abordar el primer flujo de trabajo bioinformático.

El flujo de trabajo 16S (wf-16s) de Nextflow saca el máximo partido de los flujos de trabajo de metagenómica, a fin de identificar el origen de las lecturas a partir de la secuenciación selectiva de amplicones. El flujo de trabajo tiene dos modos de funcionamiento: utiliza kraken2 o minimap2, para determinar el origen de las lecturas.

Aquí encontrará más información sobre el flujo de trabajo 16S de EPI2ME (wf-16s).

Las instrucciones de instalación se encuentran aquí.

Opciones complementarias para análizar más a fondo sus datos:

1. Herramientas para analizar datos de investigación

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio de GitHub, de Oxford Nanopore. Han sido creadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están disponibles públicamente y cuentan con un mantenimiento mínimo.

2. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y flujos bioinformáticos para analizar los datos de secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Nótese, Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química o programas informáticos.

8. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre el tema en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Al trabajar con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la purificación con microesferas AMPure

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto 1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas AMPure por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y, a continuación calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <80 % Cuando se utilice etanol a <80 %, el ADN se eluirá de las microesferas. No olvide utilizar el porcentaje correcto.

9. Problemas durante el experimento al utilizar un kit de secuenciación de base rápida

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras verificar la celda de flujo

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca podría haber dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación podría deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación del poro < al 40 % No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo En una celda de flujo MinION o GridION se cargan de 10 a 50 fmol de biblioteca de buena calidad. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to pmol").
Ocupación de los poros próxima a 0 Se utilizó el kit, Rapid PCR Barcoding V14 y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN. No olvidar seguir el protocolo paso a paso y utilizar los volúmenes y las temperaturas de incubación correctos. Es posible preparar una biblioteca de lambda control para valorar la integridad de los reactivos.
Ocupación de los poros próxima a 0 No hay anclaje en la celda de flujo Los anclajes se añaden mientras se acondiciona la celda de flujo (vial FCT). El anclaje debe añadirse al enjuague (vial FCF) antes de acondicionar la celda de flujo.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción y preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles".		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta:

1. Realizar un purgado de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca podrían dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de acondicionamiento y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte los métodos de extracción de ADN en la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Last updated: 1/14/2025

Document options

MinION
Language: