Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
MinION: Protocol
Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24) V 16S_9199_v114_revD_03Oct2024
A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.
- Genus-level bacterial identification
- Multiplex up to 24 different samples
- Compatible with R10.4.1 flow cells only
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
Sequencing and data analysis
Troubleshooting
Descripción general
A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.
- Genus-level bacterial identification
- Multiplex up to 24 different samples
- Compatible with R10.4.1 flow cells only
For Research Use Only
1. Overview of the protocol
Introduction to the 16S Barcoding Kit 24 V14
This protocol describes how to carry out rapid barcoding of 16S amplicons using the 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24). Due to the presence of both highly conserved (adequate for universal primers and phylogenetic signal) and highly variant regions (different across species), the 16S rRNA gene is often used for sequence-based bacterial identification.
The 16S Barcoding Kit 24 V14 enables access to rapid 16S sequencing for organism identification. By narrowing down to a specific region of interest, you can see all the organisms in the sample without sequencing unnecessary regions of the genome, making the test quicker and more economical. There are 24 unique barcodes, allowing you to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment.
After sequencing, you can perform downstream analysis using the EPI2ME 16S workflow (wf-16s) to classify 16S amplicons from your samples.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Extract your gDNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run
Library preparation
The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.
| Library preparation step | Process | Time | Stop option |
|---|---|---|---|
| 16S barcoded PCR amplification | Amplify the 16S gene using barcodes supplied in the kit | 10 minutes + PCR | 4°C overnight |
| Barcoded sample pooling and bead clean-up | Quantify and pool the barcoded samples and perform a library clean-up using beads | 15 minutes | 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell. -80°C for single-use long-term storage. |
| Adapter ligation | Attach the rapid sequencing adapters to the to the DNA ends. | 5 minutes | We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted. |
| Priming and loading the flow cell | Prime the flow cell and load the prepared DNA library for sequencing | 5 minutes |
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
- Optional: Start the EPI2ME software and select the wf-16S workflow
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
- R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Flow Cell Priming Kit V14 (EXP-FLP004)
- MinION Mk1C - MinION Mk1C IT requirements document
- MinION Mk1B - MinION IT Requirements document
2. Equipment and consumables
Material
- 10 ng high molecular weight genomic DNA
- 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Termociclador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Multichannel pipette and tips
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
For this protocol, you will need 10 ng high molecular weight genomic DNA per barcode.
For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across multiple barcodes so at least 4 barcodes are run (e.g. for 2 samples, use 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B). Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
16S Barcoding Kit 24 V14 contents
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
|---|---|---|---|---|
| 16S Barcode Primers 01-24 | 1-24 | - | 2 plates, 3 sets of barcodes per plate | 15 μl per well |
| Rapid Adapter | RA | Green | 1 | 15 |
| Adapter Buffer | ADB | Clear | 1 | 100 |
| AMPure XP Beads | AXP | Clear cap, light teal label | 1 | 6,000 |
| Elution buffer | EB | Black | 1 | 1,500 |
| EDTA | EDTA | Blue | 1 | 700 |
| Sequencing Buffer | SB | Red | 1 | 700 |
| Library Beads | LIB | Pink | 1 | 600 |
| Library Solution | LIS | White cap, pink label | 1 | 600 |
| Flow Cell Flush | FCF | Clear cap, light blue label | 1 | 8,000 |
| Flow Cell Tether | FCT | Purple | 1 | 200 |
Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.
3. Library preparation
Material
- 10 ng high molecular weight genomic DNA
- 16S Barcodes in 96-well plate, at 1 μM each
- EDTA (EDTA)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB)
- Rapid Adapter (RA)
- Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Termociclador
- Microcentrífuga
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Multichannel pipette and tips
Minimum 16S Barcode Primers use requirements
For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across barcodes so a minimum of 4 barcodes are run:
- For 1 sample, run your sample across 4 barcodes (e.g. 16S Barcode Primers 01-04 using 10 ng of sample A per barcode)
- For 2 samples, run each sample across two barcodes. (e.g. 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B)
- For 3 samples, run two samples individually and one across 2 barcodes. (e.g. 16S Barcode Primer 01 and 16S Barcode Primer 02 for sample A and B respectively, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample C)
Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Take one 96-well plate containing 16S barcodes. Break one set of barcodes (1-24, or as desired) away from the plate and return the rest to storage.
16S barcode plate layout:
IMPORTANTE
The 96-well plates are designed to break in one direction only. Strips, or multiple strips, of eight wells/barcodes can be removed from the plate at any one time.
Thaw the desired barcodes at room temperature.
Briefly centrifuge barcodes in a microfuge to make sure the liquid is at the bottom of the tubes and place on ice.
Thaw the LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix, spin down briefly, mix well by pipetting and place on ice.
Prepare the DNA in nuclease-free water.
- Transfer 10 ng of each genomic DNA sample into a 0.2 ml thin-walled PCR tube
- Adjust the volume to 15 μl with nuclease-free water
- Mix thoroughly by flicking avoiding unwanted shearing
- Spin down briefly in a microfuge
In each 0.2 ml thin-walled PCR tube containing a sample to be tested, prepare the following mixture:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| 10 ng input DNA (from previous step) | 15 μl |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | 25 μl |
| Total | 40 μl |
Note: If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.
Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.
Using clean pipette tips, carefully pierce the foil surface of the required barcodes. Use a new tip for each barcode to avoid cross-contamination. Make a note of which barcode numbers will be run for each sample.
Using a multichannel pipette, mix the 16S barcodes by pipetting up and down 10 times. Transfer 10 μl of each 16S Barcode into respective sample-containing tubes.
Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting the contents of the tubes 10 times and spin down.
Note: Mix gently to minimise introducing air bubbles to the reactions.
Amplify using the following cycling conditions:
| Cycle step | Temperature | Time | No. of cycles |
|---|---|---|---|
| Initial denaturation | 95 °C | 1 min | 1 |
| Denaturation | 95 °C | 20 secs | 25 |
| Annealing | 55 °C | 30 secs | 25 |
| Extension | 65 °C | 2 mins | 25 |
| Final extension | 65 °C | 5 mins | 1 |
| Hold | 4 °C | ∞ |
Thaw reagents at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting or vortexing |
|---|---|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Adapter Buffer (ADB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| AMPure XP Beads (AXP) | ✓ | ✓ | Mix by vortexing immediately before use |
| Elution Buffer (EB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| EDTA (EDTA) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
Note: Once thawed, keep all reagents on ice.
Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.
CONSEJO
EDTA is added at this step to stop the reaction.
Incubate for 5 minutes at room temperature.
Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.
Pool all barcoded samples in equimolar ratios in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward an equimolar concentration of each of the samples for optimal barcode balancing. Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:
| Volume of barcoded sample pool | 37.5 μl | 75 μl | 150 μl | 300 μl | 600 μl |
|---|---|---|---|---|---|
| Volume of AMPure XP Beads (AXP) | 22.5 μl | 45 μl | 90 μl | 180 μl | 360 μl |
Note: Table contains example volumes for reference. Please adjust the volume of AMPure XP Beads (AXP) added for the volume of your barcoded sample pool to ensure a 0.6X volume ratio.
Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.
Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
- Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
- Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.
Transfer 50 fmol of your eluted sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).
In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | 1.5 μl |
| Adapter Buffer (ADB) | 3.5 μl |
| Total | 5 μl |
Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.
FIN DEL PROCESO
The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.
4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell
Material
- Flow Cell Flush (FCF)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Uso de Library Solution (LIS)
En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:
| Reagents | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Final total volume in tube | 1,205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
5. Data acquisition and basecalling
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.
4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.
6. Flow cell reuse and returns
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
7. Downstream analysis
Análisis posterior a la identificación de bases (1)
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:
1. Plataforma EPI2ME
La plataforma EPI2ME es un servicio de análisis de datos, alojado en la red, desarrollado por Metrichor Ltd., filial de Oxford Nanopore Technologies. EPI2ME ofrece una serie de procesos de análisis, p. ej., de identificación metanogenómica, identificación de especies a partir de un código de barras (barcoding), alineación e identificación de variantes estructurales. El análisis no requiere equipo ni capacidad computacional extra y proporciona un informe fácil de interpretar con los resultados. Para obtener información sobre cómo realizar un proceso de análisis en EPI2ME, seguir las instrucciones del mismo protocolo, empezando por el paso "Starting data analysis".
2. EPI2ME Labs, tutoriales y procesos de trabajo
Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
3. Herramientas de análisis para la investigación
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
4. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
Additional options for further analysing your basecalled data include:
1. Research analysis tools
Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, that are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.
2. Community-developed analysis tools
If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the Bioinformatics section of the Resource centre. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.
8. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Low DNA recovery after AMPure bead clean-up
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Low recovery | DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio | 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample. 2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up. |
| Low recovery | DNA fragments are shorter than expected | The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use.  |
| Low recovery after end-prep | The wash step used ethanol <80% | DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage. |
9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA | Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 10/3/2024
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