Ligation sequencing V14 — single-cell transcriptomics with 5' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114)
Protocol
Ligation sequencing V14 — single-cell transcriptomics with 5' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) VSST_9204_v114_revF_06Mar2024
Single-cell transcriptomics method:
- Requires cDNA amplicons produced using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2)
- Library preparation time ~135 minutes
- High output
- PCR required
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
- 3. PCR amplification
- 4. End-prep
- 5. Adapter ligation and clean-up
- 6. Priming and loading the PromethION Flow Cell
Sequencing and data analysis
Troubleshooting
Overview
Single-cell transcriptomics method:
- Requires cDNA amplicons produced using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2)
- Library preparation time ~135 minutes
- High output
- PCR required
For Research Use Only
1. Overview of the protocol
Introduction to the single-cell 5' transcriptomics protocol
This application allows the sequencing of full-length 5' cDNA transcripts, which provides a complete view of the expressed isoforms and allows detection of alternative splicing and fusion events in individual cells. Additionally, it enables the detection of SNPs anywhere in the transcript, as well as identification of cell sub-types in a population based on isoform expression levels.
This protocol describes how to carry out sequencing of cDNA from single cells using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). You will need to have reverse-transcribed single-cell mRNA into cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2) before performing PCR amplification of your cDNA with custom-ordered oligos. Finally, a standard Ligation Sequencing Kit V14 library preparation is completed to prepare the cDNA ends for sequencing on a PromethION device.
This is an optimised protocol adapted from our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.
The original 3' protocol was adapted from Lebrigand, K., Magnone, V., Barbry, P. et al. High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing. Nat Commun 11, 4025 (2020) to sequence full-length transcripts, deplete cDNA synthesis artifacts and to correct for strand bias.
Note: This protocol is compatible and fully supported with the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2).
For the 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1), please visit our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Have previously prepared single-cell cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2). The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
- Download the MinKNOW software for acquiring and analysing your data.
- Perform a flow cell check to ensure it has enough pores for a good sequencing run.
Library preparation
| Protocol step | Process | Time | Stop option |
|---|---|---|---|
| PCR amplification | Amplify your cDNA by PCR | 80 minutes | - |
| End-prep | Prepare the cDNA ends for adapter attachment | 30 minutes | 4°C overnight |
| Adapter ligation and clean-up | Attach sequencing adapters to the cDNA | 20 minutes | 4°C for short-term storage or for repeated use, such as for reloading your flow cell –80°C for long-term storage |
| Priming and loading the flow cell | Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing | 5 minutes |
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
- Analyse the data using the EPI2ME wf-single-cell pipeline.
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
- R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- PromethION device - PromethION IT Requirements document
2. Equipment and consumables
Material
- 10 ng of cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2)
- Custom-ordered oligo at 10 μM: Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA (sequence provided below)
- Custom-ordered oligo at 10 μM: Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA (sequence provided below)
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
Consumibles
- PromethION Flow Cell (FLO-PRO114M)
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- Agilent Technologies DNA 12000 Kit
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
- 15 ml Falcon tubes
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- PromethION Flow Cell Light Shield
- PromethION device
- Agilent Bioanalyzer (or equivalent)
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Magnetic rack (e.g. Invitrogen DynaMag-2 Magnet, Cat # 12321D)
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Thermal cycler
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
For this protocol, you will need 10 ng amplified cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2).
IMPORTANTE
10X Genomics kits
Note: This protocol is compatible and fully supported with 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2).
The 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1) is compatible with our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.
The Visium Spatial Gene Expression Kit is also compatible with the 3' method, but has not been validated by our internal teams.
Custom-ordered oligo sequences
Order the following HPLC-purified oligos at 100 μM, and dilute to 10 μM in TE buffer for use in the PCR amplification step of the library prep.
| Name | Sequence |
|---|---|
| Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA | 5'-/5phos/ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCCTACACGA CGCTCTTCCGATCT-3' |
| Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA | 5'-/5phos/TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAAGCAGTG GTATCAACGCAGAG-3' |
AMPure XP beads
Extra AMPure XP Beads will be required for the first steps when preparing the cDNA amplicons. From the end-prep step, the AMPure XP Beads (AXP) from the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) can be used.
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.
Formato de tubos monouso 
Formato en botella 
Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.
Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.
3. PCR amplification
Material
- 10 ng of cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2)
- Custom-ordered oligo at 10 μM: Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA (sequence provided in Equipment and Consumables)
- Custom-ordered oligo at 10 μM: Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA (sequence provided in Equipment and Consumables)
Consumibles
- LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™ cat # A63881)
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- Agilent Technologies DNA 12000 Kit
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat #AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Termociclador
- Microfuge
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Magnetic rack (e.g. Invitrogen DynaMag-2 Magnet, Cat # 12321D)
- Ice bucket with ice
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P20 pipette and tips
- P2 pipette and tips
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
- Bioanalizador Agilent (o equivalente)
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Prepare the cDNA amplicons in nuclease-free water:
- Transfer 10 ng of cDNA amplicons into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
- Adjust the volume to 21 µl with nuclease-free water.
- Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
- Spin down briefly in a microfuge.
In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, set up the following reaction:
| Reagent | Stock | Final | Volume |
|---|---|---|---|
| cDNA template | 0.48 ng/μl | 0.2 ng/μl | 21 μl |
| Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA | 10 μM | 0.4 μM | 2 μl |
| Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA | 10 μM | 0.4 μM | 2 μl |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | 2X | 1X | 25 μl |
| Total | - | - | 50 μl |
Mix by pipetting and spin down.
Amplify using the following cycling conditions:
| Cycle step | Temperature | Ramp rate | Time | No. of cycles |
|---|---|---|---|---|
| Initial denaturation | 94°C | max | 3 min | 1 |
| Denaturation Annealing ramp-down Annealing Extension | 94°C 66°C down to 58°C 58°C 65°C | max 0.2°C/s max max | 30 sec 40 sec 50 sec 6 mins | 8 |
| Final extension | 65°C | max | 10 min | 1 |
| Hold | 4°C | - | ∞ | - |
Below is a schematic of the cycling conditions. 
Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.
Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by flicking the tube.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.
Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol in nuclease-free water without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
Repeat the previous step.
Briefly spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 15 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 2 minutes at room temperature.
Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.
Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Dispose of the pelleted beads
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer - recovery aim >50 ng total.
Quantify 200 fmol of cDNA from the average fragment size identified using an Agilent Bioanalyzer.
Alternatively, assume an average fragment size of 1 kbp.
Figure: Example amplicon fragment length distribution: 3 biological replicates of 5' cDNA from PBMCs prepared using the 10x genomics 5' gene expression v2 kit, processed using the Oxford Nanopore Technologies 5' 10x cDNA protocol. Here the amplicons have been analysed using the Agilent Bioanalyzer 2100 and DNA 12000 kit.
FIN DEL PROCESO
Take forwards 200 fmol of cDNA amplicons into the end-prep step.
4. End-prep
Material
- 200 fmol cDNA amplicons
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
- NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
- NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P10
- Thermal cycler
- Microcentrífuga
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:
For optimal performance, NEB recommend the following:
Thaw all reagents on ice.
Ensure the reagents are well mixed.
Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.Always spin down tubes before opening for the first time each day.
The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.
Transfer 200 fmol of cDNA amplicons into a clean 0.2 ml thin-walled PCR tube and adjust the volume to 50 µl with nuclease-free water.
In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:
Between each addition, pipette mix 10-20 times.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| cDNA amplicons | 50 µl |
| Ultra II End-prep Reaction Buffer | 7 µl |
| Ultra II End-prep Enzyme Mix | 3 µl |
| Total | 60 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.
Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
FIN DEL PROCESO
Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.
5. Adapter ligation and clean-up
Material
- Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
- Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
- Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Gradilla magnética
- Hula mixer (rotator mixer)
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO
Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).
La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).
La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen mayor eficacia y ligación.
IMPORTANTE
Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.
Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.
Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.
Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.
En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:
Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra de ADN del paso anterior | 60 µl |
| Ligation Buffer (LNB) | 25 µl |
| NEBNext Quick T4 DNA Ligase | 10 µl |
| Ligation Adapter (LA) | 5 µl |
| Total | 100 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Wash the beads by adding 250 μl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.
Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 34 µl Elution Buffer (EB).
Spin the sample down briefly and incubate for 10 minutes at room temperature.
Note: For high molecular weight DNA, incubating at 37°C can improve the recovery of long fragments.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 34 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.
Prepare 50–100 fmol of your final library to 32 µl with Elution Buffer (EB).
Alternatively, assume an average fragment length of 1 kbp and proceed with 33 ng of library.
Note: If your DNA library is below the required concentration, take forward the full volume of 32 µl eluted DNA for sequencing.
Caution: Please note, very low recovery could be indicative of library preparation failiure.
If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.
IMPORTANTE
We recommend loading 50–100 fmol of this final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.
Loading the recommended concentration onto the flow cell will ensure optimal pore occupancy for high sequencing output. Dilute the library in Elution Buffer if required.
FIN DEL PROCESO
La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.
CONSEJO
Recomendaciones de guardado de la biblioteca
Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.
6. Priming and loading the PromethION Flow Cell
Material
- Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Library Solution (LIS)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
Consumibles
- Celda de flujo PromethION
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- PromethION device
- PromethION Flow Cell Light Shield
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P20 pipette and tips
IMPORTANTE
This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
To prepare the flow cell priming mix, combine Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF), as directed below. Mix by vortexing at room temperature.
Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format. Please follow the instructions for your kit format.
Single-use tubes format: Add 30 µl Flow Cell Tether (FCT) directly to a tube of Flow Cell Flush (FCF).
Bottle format: In a clean suitable tube for the number of flow cells, combine the following reagents:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,170 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Total volume | 1,200 µl |
IMPORTANTE
Una vez sacadas de la nevera, esperar 20 minutos antes de insertar las celdas de flujo en el dispositivo y así darles tiempo a que estén a temperatura ambiente. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Procure que la almohadilla térmica (color negro) esté enganchada en la parte posterior.
For PromethION 2 Solo, load the flow cell(s) as follows:
Place the flow cell flat on the metal plate.
Slide the flow cell into the docking port until the gold pins or green board cannot be seen.
For the PromethION 24/48, load the flow cell(s) into the docking ports:
- Line up the flow cell with the connector horizontally and vertically before smoothly inserting into position.
- Press down firmly onto the flow cell and ensure the latch engages and clicks into place.
IMPORTANTE
Insertion of the flow cells at the wrong angle can cause damage to the pins on the PromethION and affect your sequencing results. If you find the pins on a PromethION position are damaged, please contact support@nanoporetech.com for assistance.
Slide the inlet port cover clockwise to open.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the inlet port, draw back a small volume to remove any air bubbles:
- Set a P1000 pipette tip to 200 µl.
- Insert the tip into the inlet port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you see a small volume of buffer entering the pipette tip.
Load 500 µl of the priming mix into the flow cell via the inlet port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait five minutes. During this time, prepare the library for loading using the next steps in the protocol.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 100 µl |
| Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) | 68 µl |
| DNA library | 32 µl |
| Total | 200 µl |
Note: Library loading volume has been increased to improve array coverage.
Complete the flow cell priming by slowly loading 500 µl of the priming mix into the inlet port.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Load 200 µl of library into the inlet port using a P1000 pipette.
Close the valve to seal the inlet port.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
If the light shield has been removed from the flow cell, install the light shield as follows:
- Align the inlet port cut out of the light shield with the inlet port cover on the flow cell. The leading edge of the light shield should sit above the flow cell ID.
- Firmly press the light shield around the inlet port cover. The inlet port clip will click into place underneath the inlet port cover.
FIN DEL PROCESO
Close the PromethION lid when ready to start a sequencing run on MinKNOW.
Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.
7. Data acquisition and basecalling
How to start sequencing
Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.
MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:
- On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
- Directly on a PromethION 24/48 sequencing device.
For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:
Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.
Click on your connected device.
Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.
Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-PRO114M flow cell type from the drop-down menu.
Click Continue to kit selection.
Select the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).
An expansion kit does not need to be selected.
Click Continue to Run Options to continue.
Set the run options to a 72 hour run length and 200 bp minimum read length.
Click Continue to basecalling to continue.
Set up basecalling using the following parameters:
- Ensure the basecalling is switched ON.
- Next to "Models", click Edit options and choose High-accuracy baseceller (HAC) from the drop-down menu.
- Ensure barcoding is OFF.
Click Continue to output and continue.
Keep the output format and filtering options to their default settings.
However, .fast5 output can be used if you cannot use .pod5 output files.
Click Continue to final review to continue.
Click Start to start sequencing.
You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.
Data analysis after sequencing
After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.
After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.
8. Flow cell reuse and returns
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
9. Downstream analysis
EPI2ME provides a Nextflow-based workflow for the analysis of single-cell sequencing data.
The workflow, wf-single-cell, processes the FASTQ format sequence data prepared by the MinKNOW software. The workflow screens each sequence read for 10X cell barcode information and assigns reads to a cell of origin. A subset of sequences from “true” cells are dynamically filtered on the basis of the number of assigned sequence reads. These sequences are mapped to the reference genome, and tables of both gene and transcript abundance are prepared for each cell. These "cell barcode x gene" or transcript abundance information are used to prepare the familiar UMAP plots that may show the stratification of the cell types present within the sample.
For more information on this workflow, follow the link to the GitHub documentation.
10. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas (1)
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra (1)
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
11. Issues during the sequencing run
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA | Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation | Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos (1)
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 8/21/2024
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