Protocol

Ligation sequencing DNA V14 - dual barcoding (SQK-NBD114.24 with EXP-PBC096) VDBC_9184_v114_revJ_22Mar2023

For barcoding genomic or amplicon DNA for nanopore sequencing.
Offering highest accuracy
Multiplexing up to 2,304 samples
Requires PCR steps
Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Overview

For barcoding genomic or amplicon DNA for nanopore sequencing.
Offering highest accuracy
Multiplexing up to 2,304 samples
Requires PCR steps
Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: DBC_9184_v114_revJ_22Mar2023

1. Overview of the protocol

Dual Barcoding V14 features:

This protocol requires the use of two kits to generate the dual barcoded libraries:

PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096): up to 96 unique barcodes are available. These PCR barcodes are used as the primary "inner" barcodes.
Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24): up to 24 unique barcodes are available. These native barcodes are used as the secondary "outer" barcodes.

These kits are used in successive order and recommended for users who:

Want to multiplex up to 2,304 samples, depending on the barcodes they are using from each expansion.
Would like to achieve raw read sequencing modal accuracy of Q20+ (99%) or above.
Require control over read length.
Would like to utilise upstream processes such as size selection or whole genome amplification.

Introduction to the V14 dual barcoding protocol

This protocol allows massively parallel sequencing of up to 2,304 samples (gDNA or amplicons) on a single flow cell. It uses both the PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096) and the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24).

Samples are initially PCR barcoded with the PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096), allowing up to 96 samples to be pooled together. There can be up to 24 pools of 96 samples. Each pool of 96 samples will then undergo secondary barcoding through the ligation of one of 24 native barcodes using the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). After secondary barcoding, all pools are combined into a single library for sequencing.

Note: For amplicon inputs, first-round PCR product with the following tailed primers are required. 5’ TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC-[ project-specific forward primer sequence ] 3’ 5’ ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC-[ project-specific reverse primer sequence ] 3’

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
Download the software for acquiring and analysing your data
Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

Prepare the DNA ends for adapter attachment
Attach barcoding adapters supplied in the 96 PCR Barcoding kit to the DNA ends
Amplify each barcoded sample by PCR, then pool the 96 samples together (up to 24 pools of 96 samples can be generated)
Prepare the DNA ends of your pooled samples for native barcode attachment
Ligate native barcodes to the DNA ends for each pool of 96 samples
Pool up to 24 native barcoded libraries together
Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends of your combined dual barcoded libraries
Prime the flow cell, and load your dual barcoded DNA library into the flow cell

Sequencing and analysis

You will need to:

In the current MinKNOW software version, we recommend setting up live basecalling during the sequencing run without live barcoding. Demultiplexing of the dual barcoded reads will be carried out post-run:
- Start a sequencing run in the MinKNOW software using SQK-LSK114, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
- Demultiplex your run post-sequencing unsing the MinKNOW software.
Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow for further analysis (this step is optional).

IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

PCR Barcoding Expansion Pack 1-96 (EXP-PBC096)
Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114)
Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
MinION Mk1B - MinION Mk1B IT requirements document
MinION Mk1C - MinION Mk1C IT requirements document
GridION - GridION IT requirements document

2. Equipment and consumables

Material

100 ng of each sheared DNA sample to be barcoded in 45 µl
OR 100 ng first-round PCR product (with tailed primers) per sample
PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096)
Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)

Consumibles

Celda de flujo MinION/GridION
NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
(Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)

Instrumental

Dispositivo MinION o GridION
Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Microcentrífuga
Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
Mezclador vórtex
Termociclador
Magnetic rack
Multichannel pipette and tips
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P200
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20
Pipeta y puntas P10
Pipeta y puntas P2
Cubeta con hielo
Temporizador
Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Equipo opcional

Bioanalizador Agilent (o equivalente)
Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

100 ng of gDNA is required per sample.

If using amplicons, 100 ng of first-round PCR product (with tailed primers) is required per sample.

IMPORTANTE

Fragmentation and size selection

For successful amplification, it is critical that the DNA fragment distribution of templates used in the PCR are <8 Kbp. If the input DNA is not < Kbp, use follow steps outline in Shearing genomic DNA using the Covaris g-TUBE™ to shear the sample to each a fragment distribution <8 Kbp.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments. Instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo	Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle	50
MinION/GridION	800
PromethION	5000

IMPORTANTE

AMPure XP Beads

Within the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24), AMPure XP Beads (AXP) are supplied at the volume needed to complete the native barcoding sections of the protocol: the second "End-prep", "Native barcode ligation" and "Adapter ligation and clean-up".

However, extra AMPure XP Beads are required for the PCR barcoding steps of the protocol: the first "End-prep", "Ligation of Barcode Adapter" and "Barcoding PCR".

Please note, other purification methods are available.

PCR Barcoding Expansion Pack 1-96 (EXP-PBC096)

Name	Acronym	Cap colour	No. of vials/plates	Fill volume per well (µl)
PCR Barcode Primer Mix plate	BC01-96	White	1 plate	24
Barcode Adapter plate	BCA	Blue	1 plate	240

Layout of barcodes in the 96 tube plate

The wells of the 96 tube plate correspond to the barcodes in the following way. All barcodes are supplied at 10 µM concentration and to be used at a final concentration of 0.2 µM.

Capping and decapping the 96 well format

IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format and reducing the concentration of EDTA.

Single-use tubes format with higher EDTA concentration:

Higher concentration of EDTA with a clear cap.

Bottle format with reduced EDTA concentration:

Reduced concentration of EDTA with a blue cap.

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

96 barcode sequences

Component	Sequence
BC01 / RB01	AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
BC02 / RB02	TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
BC03 / RB03	GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
BC04 / RB04	TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
BC05 / RB05	CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
BC06 / RB06	TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
BC07 / RB07	GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
BC08 / RB08	TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
BC09 / RB09	AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
BC10 / RB10	AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
BC11 / RB11	GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
BC12 / RB12	CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
BC13 / 16S13 / RB13	AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA
BC14 / 16S14 / RB14	AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA
BC15 / 16S15 / RB15	AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG
BC16 / 16S16 / RB16	CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT
BC17 / 16S17 / RB17	ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT
BC18 / 16S18 / RB18	CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC
BC19 / 16S19 / RB19	GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT
BC20 / 16S20 / RB20	TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT
BC21 / 16S21 / RB21	GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA
BC22 / 16S22 / RB22	ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG
BC23 / 16S23 / RB23	CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG
BC24 / 16S24 / RB24	GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG
BC25 / RB25	GTAAGTTGGGTATGCAACGCAATG
BC26 / RB26	CATACAGCGACTACGCATTCTCAT
BC27 / RB27	CGACGGTTAGATTCACCTCTTACA
BC28 / RB28	TGAAACCTAAGAAGGCACCGTATC
BC29 / RB29	CTAGACACCTTGGGTTGACAGACC
BC30 / RB30	TCAGTGAGGATCTACTTCGACCCA
BC31 / RB31	TGCGTACAGCAATCAGTTACATTG
BC32 / RB32	CCAGTAGAAGTCCGACAACGTCAT
BC33 / RB33	CAGACTTGGTACGGTTGGGTAACT
BC34 / RB34	GGACGAAGAACTCAAGTCAAAGGC
BC35 / RB35	CTACTTACGAAGCTGAGGGACTGC
BC36 / RB36	ATGTCCCAGTTAGAGGAGGAAACA
BC37 / RB37	GCTTGCGATTGATGCTTAGTATCA
BC38 / RB38	ACCACAGGAGGACGATACAGAGAA
BC39 / RB39	CCACAGTGTCAACTAGAGCCTCTC
BC40 / RB40	TAGTTTGGATGACCAAGGATAGCC
BC41 / RB41	GGAGTTCGTCCAGAGAAGTACACG
BC42 / RB42	CTACGTGTAAGGCATACCTGCCAG
BC43 / RB43	CTTTCGTTGTTGACTCGACGGTAG
BC44 / RB44	AGTAGAAAGGGTTCCTTCCCACTC
BC45 / RB45	GATCCAACAGAGATGCCTTCAGTG
BC46 / RB46	GCTGTGTTCCACTTCATTCTCCTG
BC47 / RB47	GTGCAACTTTCCCACAGGTAGTTC
BC48 / RB48	CATCTGGAACGTGGTACACCTGTA
BC49 / RB49	ACTGGTGCAGCTTTGAACATCTAG
BC50 / RB50	ATGGACTTTGGTAACTTCCTGCGT
BC51 / RB51	GTTGAATGAGCCTACTGGGTCCTC
BC52 / RB52	TGAGAGACAAGATTGTTCGTGGAC
BC53 / RB53	AGATTCAGACCGTCTCATGCAAAG
BC54 / RB54	CAAGAGCTTTGACTAAGGAGCATG
BC55 / RB55	TGGAAGATGAGACCCTGATCTACG
BC56 / RB56	TCACTACTCAACAGGTGGCATGAA
BC57 / RB57	GCTAGGTCAATCTCCTTCGGAAGT
BC58 / RB58	CAGGTTACTCCTCCGTGAGTCTGA
BC59 / RB59	TCAATCAAGAAGGGAAAGCAAGGT
BC60 / RB60	CATGTTCAACCAAGGCTTCTATGG
BC61 / RB61	AGAGGGTACTATGTGCCTCAGCAC
BC62 / RB62	CACCCACACTTACTTCAGGACGTA
BC63 / RB63	TTCTGAAGTTCCTGGGTCTTGAAC
BC64 / RB64	GACAGACACCGTTCATCGACTTTC
BC65 / RB65	TTCTCAGTCTTCCTCCAGACAAGG
BC66 / RB66	CCGATCCTTGTGGCTTCTAACTTC
BC67 / RB67	GTTTGTCATACTCGTGTGCTCACC
BC68 / RB68	GAATCTAAGCAAACACGAAGGTGG
BC69 / RB69	TACAGTCCGAGCCTCATGTGATCT
BC70 / RB70	ACCGAGATCCTACGAATGGAGTGT
BC71 / RB71	CCTGGGAGCATCAGGTAGTAACAG
BC72 / RB72	TAGCTGACTGTCTTCCATACCGAC
BC73 / RB73	AAGAAACAGGATGACAGAACCCTC
BC74 / RB74	TACAAGCATCCCAACACTTCCACT
BC75 / RB75	GACCATTGTGATGAACCCTGTTGT
BC76 / RB76	ATGCTTGTTACATCAACCCTGGAC
BC77 / RB77	CGACCTGTTTCTCAGGGATACAAC
BC78 / RB78	AACAACCGAACCTTTGAATCAGAA
BC79 / RB79	TCTCGGAGATAGTTCTCACTGCTG
BC80 / RB80	CGGATGAACATAGGATAGCGATTC
BC81 / RB81	CCTCATCTTGTGAAGTTGTTTCGG
BC82 / RB82	ACGGTATGTCGAGTTCCAGGACTA
BC83 / RB83	TGGCTTGATCTAGGTAAGGTCGAA
BC84 / RB84	GTAGTGGACCTAGAACCTGTGCCA
BC85 / RB85	AACGGAGGAGTTAGTTGGATGATC
BC86 / RB86	AGGTGATCCCAACAAGCGTAAGTA
BC87 / RB87	TACATGCTCCTGTTGTTAGGGAGG
BC88 / RB88	TCTTCTACTACCGATCCGAAGCAG
BC89 / RB89	ACAGCATCAATGTTTGGCTAGTTG
BC90 / RB90	GATGTAGAGGGTACGGTTTGAGGC
BC91 / RB91	GGCTCCATAGGAACTCACGCTACT
BC92 / RB92	TTGTGAGTGGAAAGATACAGGACC
BC93 / RB93	AGTTTCCATCACTTCAGACTTGGG
BC94 / RB94	GATTGTCCTCAAACTGCCACCTAC
BC95 / RB95	CCTGTCTGGAAGAAGAATGGACTT
BC96 / RB96	CTGAACGGTCATAGAGTCCACCAT

Native barcode sequences

Component	Forward sequence	Reverse sequence
NB01	CACAAAGACACCGACAACTTTCTT	AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
NB02	ACAGACGACTACAAACGGAATCGA	TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
NB03	CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC	GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
NB04	TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA	TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
NB05	AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG	CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
NB06	GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA	TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
NB07	AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC	GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
NB08	ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA	TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
NB09	AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT	AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
NB10	GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT	AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
NB11	TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC	GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
NB12	TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG	CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
NB13	AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA	TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT
NB14	AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA	TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT
NB15	AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG	CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT
NB16	CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT	AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG
NB17	ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT	ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT
NB18	CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC	GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG
NB19	GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT	ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC
NB20	TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT	ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA
NB21	GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA	TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC
NB22	ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG	CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT
NB23	CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG	CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG
NB24	GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG	CTAACCCATCATGCAGAACTATGC

3. End-prep

Material

100 ng of each sheared DNA sample to be barcoded in 45 µl

Consumibles

NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)

Instrumental

P1000 pipette and tips
P100 pipette and tips
Pipeta y puntas P10
Termociclador
Cubeta con hielo
Microfuge
Magnetic rack
Vortex mixer

Equipo opcional

Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

For optimal performance, NEB recommend the following:

Thaw all reagents on ice.
Ensure the reagents are well mixed.
Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.
Always spin down tubes before opening for the first time each day.
The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Transfer 100 ng DNA of each sample into a fresh 0.2 ml PCR tube or plate
Adjust the volume to 45 μl with nuclease-free water
Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing
Spin down briefly in a microfuge

Reagent	Volume per sample
100 ng DNA	45 µl
Ultra II End-prep reaction buffer	7 µl
Ultra II End-prep enzyme mix	3 µl
Nuclease-free water	5 µl
Total	60 µl

FIN DEL PROCESO

Take forward the end-prepped DNA into the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

4. Ligation of Barcode Adapter

Material

Barcode Adapter (BCA)

Consumibles

NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, cat # M0367)
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)

Instrumental

Microfuge
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Mezclador vórtex
Cubeta con hielo
Multichannel pipette and tips
Magnetic rack
P1000 pipette and tips
P100 pipette and tips
Pipeta y puntas P10
Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Thaw the reagents at room temperature.
Spin down the reagent tubes for 5 seconds.
Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Reagent	Volume
End-prepped DNA	15 µl
Barcode Adapter	10 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix	25 µl
Total	50 µl

Dispose of the pelleted beads.

FIN DEL PROCESO

Take forward the adapter ligated samples into the Barcoding PCR step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. Barcoding PCR

Material

PCR Barcodes (BC01-96, at 10 µM)

Consumibles

LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)

Instrumental

Thermal cycler
Magnetic rack
Microfuge
P1000 pipette and tips
P100 pipette and tips
Pipeta y puntas P10
Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Please note, this protocol is written for a template input of 100–200 fmol with PCR Barcodes (BC01-96) used at a final concentration of 0.2 µM. However, the input mass and the number of PCR cycles may be adjusted as appropriate depending on the requirements of the experiment.

IMPORTANTE

If using amplicon samples, ensure the samples have undergone a round of PCR with tailed primers before commencing with the protocol.

Transfer 100-200 fmol of each sample to a clear 0.2 ml PCR tube or plate

For 1–12 samples: Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water
For 13–96 samples: Adjust the volume to 24 μl with nuclease-free water

Mix thoroughly by flicking the tube or plate to avoid unwanted shearing
Spin down briefly in a microfuge

Note: Only use one barcode per sample.

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent	Volume per sample for using 1–12 barcodes	Volume per sample for using 13 barcodes or more
PCR Barcode (one of BC1-BC96, at 10 µM)	2 µl	1 µl
Adapter-ligated DNA	48 µl	24 µl
LongAmp Taq 2x master mix	50 µl	25 µl
Total volume	100 µl	50 µl

Cycle step	Temperature	Time	No. of cycles
Initial denaturation	94 °C	3 mins	1
Denaturation	94 °C	15 secs	15-18 (a)
Annealing	56 °C	15 secs	15-18 (a)
Extension	65 °C	6 mins (b)	15-18 (a)
Final extension	65 °C	10 mins	1
Hold	4 °C	∞

a. Adjust accordingly if input quantities are altered.

b. Adjust accordingly for different lengths of amplicons and the type of polymerase that is being used (LongAmp Taq amplifies at a rate of 50 seconds per kb). Here 6 min is used for ~8 Kbp templates.

Reagent	Volume for 100 µl samples	Volume for 50 µl samples
AMPure XP Beads	40 µl	20 µl

Dispose of the pelleted beads

IMPORTANTE

Each PCR barcoded sample pool should contain 1–96 unique barcodes.

You will have up to 24 separate pools of 96 samples going into the end-prep and native barcode ligation section of the protocol.

Note: Do not mix different PCR barcoded sample pools prior to secondary "outer" barcoding.

If the volume of a pool exceeds the 12.5 µl required for the end-prep reaction, consider a 2.5X AMPure XP Bead purification of the pool to concentrate your sample.

FIN DEL PROCESO

The pooled barcoded libraries are now ready to be end-prepped and undergo secondary barcoding. However, at this point it is also possible to store the libraries at 4°C overnight.

6. End-prep

Material

Up to 24 pools of PCR barcoded sample pools (with up to 96 samples in each pool), each in 12.5 µl
AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)

Consumibles

NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)

Instrumental

Pipeta y puntas P1000
P200 pipette and tips
Pipeta y puntas P100
P20 pipette and tips
Pipeta y puntas P10
P2 pipette and tips
Multichannel pipette and tips
Thermal cycler
Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
Microfuge
Cubeta con hielo
Magnetic rack
Mezclador vórtex
Hula mixer (rotator mixer)
Qubit fluorometer (or equivalent)

For optimal performance, NEB recommend the following:

Thaw all reagents on ice.
Ensure the reagents are well mixed.
Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.
Always spin down tubes before opening for the first time each day.
The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent	Volume
PCR barcoded sample pool	12.5 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer	1.75 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix	0.75 µl
Total	15 µl

CONSEJO

We recommend making up a mastermix of the end-prep and DNA repair reagents for the total number of PCR barcoded sample pools and adding 2.5 µl to each well.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of each eluted end-prepped PCR barcoded sample pool using a Qubit fluorometer.

IMPORTANTE

You will have up to 24 separate end-prepped PCR barcoded sample pools to take forward into secondary barcoding via native barcode ligation.

Note: Do not mix the PCR barcoded sample pools prior to secondary "outer" barcoding.

FIN DEL PROCESO

Take forward an equimolar mass of each of the end-prepped PCR barcoded sample pools to undergo secondary barcoding in the native barcode ligation step. However, at this point it is also possible to store the PCR barcoded sample pools at 4°C overnight.

7. Native barcode ligation

Material

Native Barcodes (NB01-24)
AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
EDTA (EDTA)

Consumibles

NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)

Instrumental

Gradilla magnética
Mezclador vórtex
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Microfuge
Termociclador
Cubeta con hielo
Multichannel pipette and tips
Pipeta y puntas P1000
P200 pipette and tips
Pipeta y puntas P100
P20 pipette and tips
Pipeta y puntas P10
P2 pipette and tips
Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Thaw the reagents at room temperature.
Spin down the reagent tubes for 5 seconds.
Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Note: Only use one barcode per PCR barcoded sample pool.

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent	Volume
End-prepped DNA (PCR barcoded sample pools)	7.5 µl
Native Barcode (NB01-24)	2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix	10 µl
Total	20 µl

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

EDTA cap colour	Volume per well
For clear cap EDTA	2 µl
For blue cap EDTA	4 µl

CONSEJO

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

	Volume per PCR barcoded sample pool	For 6 sample pools	For 12 sample pools	For 24 sample pools
Total volume for preps using clear cap EDTA	22 µl	132 µl	264 µl	528 µl
Total volume for preps using blue cap EDTA	24 µl	144 µl	288 µl	576 µl

CONSEJO

We recommend checking the base of your tubes/plate are all the same volume before pooling and after to ensure all the liquid has been taken forward.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

	Volume per sample	For 6 samples	For 12 samples	For 24 samples
Volume of AXP for preps using clear cap EDTA	9 µl	53 µl	106 µl	211 µl
Volume of AXP for preps using blue cap EDTA	10 µl	58 µl	115 µl	230 µl

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

FIN DEL PROCESO

Take forward the dual barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, at this point it is also possible to store the library at 4°C overnight.

8. Adapter ligation and clean-up

Material

Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
Elution Buffer (EB)
Native Adapter (NA)
AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)

Consumibles

NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)

Instrumental

Microcentrífuga
Gradilla magnética
Mezclador vórtex
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Termociclador
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P200
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20
Pipeta y puntas P10
Ice bucket with ice
Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Thaw the reagents at room temperature.
Spin down the reagent tubes for 5 seconds.
Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

IMPORTANTE

Do not vortex the Quick T4 DNA Ligase.

IMPORTANTE

La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).

Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).
Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent	Volume
Pooled barcoded libraries	30 µl
Native Adapter (NA)	5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X)	10 µl
Quick T4 DNA Ligase	5 µl
Total	50 µl

IMPORTANTE

The next clean-up step uses Long Fragment Buffer (LFB) or Short Fragment Buffer (SFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Longitud de fragmentos	Cantidad a cargar en la celda de flujo
Muy cortos (<1 kb)	100 fmol
Cortos (1-10 kb)	35–50 fmol
Largos (>10 kb)	300 ng

Nota: Si el producto obtenido en la biblioteca está por debajo de la cantidad de muestra inicial recomendada, cargue la biblioteca entera.

Si es necesario, recomendamos utilizar una calculadora de masa a mol, como la calculadora de NEB.

FIN DEL PROCESO

The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

MEDIDA OPCIONAL

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

9. Priming and loading the SpotON flow cell

Material

Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
Library Solution (LIS)
Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)

Consumibles

Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Celda de flujo MinION/GridION
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
(Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)

Instrumental

Dispositivo MinION o GridION
Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20
Pipeta y puntas P10

IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Uso de Library Solution (LIS)

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).

Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:

Reactivo	Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF)	1 170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml	5 µl
Flow Cell Tether (FCT)	30 µl
Volumen total	1 205 µl

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

Reactivo	Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB)	37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere	25,5 µl
Biblioteca de ADN	12 µl
Total	75 µl

Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

10. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. Instructions for this can be found in the MinKNOW protocol.

MinKNOW settings for real-time basecalling:

We recommend setting up real-time basecalling as follows:

Real-time basecalling

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section for your device until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

Select Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114) in "Kit selection". The barcoding option will be unavailable as default. Other parameters can be kept at their default settings.

Post-run barcode demultiplexing:

We currently recommend performing demultiplexing for the dual barcoding protocol post-sequencing using the Guppy software.

For a complete guide please refer to our Guppy protocol

Barcode demultiplexing in Guppy for dual barcoding:

To demultiplex your reads by barcode, use the dual barcoding configuration file, specifying the barcode kit as "EXP-DUAL00":

guppy_barcoder --input_path <folder containing FASTQ and/or FASTA files> --save_path <output folder> --config configuration_dual.cfg --barcode_kits "EXP-DUAL00"

For more information and instructions on how to use Guppy, please refer to the relevant sections of the protocol:

Barcode demultiplexing Quick Start

11. Downstream analysis

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:

1. Procesos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

12. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material

Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

13. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel).	El ARN se degradó durante la extracción	Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado	El ARN se degradó durante la extracción	Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	El paso de lavado utilizó etanol a <70 %	Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

14. Issues during the sequencing run for Kit 14

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos	Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La celda de flujo no está colocada correctamente	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros	El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation	Possible cause	Comments and actions
Pore occupancy <40%	Not enough library was loaded on the flow cell	10–20 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0	The Native Barcoding Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation	Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0	No tether on the flow cell	Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles	Ciertos compuestos copurificados con ADN	Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation	Possible cause	Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run	Fast fuel consumption is typically seen in Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109) when the flow cell is overloaded with library. Please see the appropriate protocol for your DNA library to find the recommendation.	Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

Fluctuación de la temperatura

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada"	El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Device:

NCM 2024: Boston

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Nanopore Learning

Ligation sequencing DNA V14 - dual barcoding (SQK-NBD114.24 with EXP-PBC096)

Introduction to the protocol

Library preparation

Sequencing and data analysis

Troubleshooting

Document versions

Protocol

Ligation sequencing DNA V14 - dual barcoding (SQK-NBD114.24 with EXP-PBC096) VDBC_9184_v114_revJ_22Mar2023

Contents

Introduction to the protocol

Library preparation

Sequencing and data analysis

Troubleshooting

Overview

1. Overview of the protocol

Dual Barcoding V14 features:

Introduction to the V14 dual barcoding protocol

IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

2. Equipment and consumables

Material

Consumibles

Instrumental

Equipo opcional

100 ng of gDNA is required per sample.

IMPORTANTE

Fragmentation and size selection

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Contaminantes químicos

Reactivos de otros fabricantes

Verificar la celda de flujo

IMPORTANTE

AMPure XP Beads

PCR Barcoding Expansion Pack 1-96 (EXP-PBC096)

Layout of barcodes in the 96 tube plate

Capping and decapping the 96 well format

IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

96 barcode sequences

Native barcode sequences

3. End-prep

Material

Consumibles

Instrumental

Equipo opcional

CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

Prepare the DNA in nuclease-free water.

Set up the end-repair reaction as follows for each library:

Mix by pipetting and briefly spin down.

Using a thermal cycler, incubate for 5 minutes at 20 °C and 5 minutes at 65 °C.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to the end-prep reaction and mix by pipetting.

Incubate at room temperature for 5 minutes.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Spin down the samples and pellet on a magnet until supernatant is clear and colourless. Keep the samples on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the samples on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Spin down and place the samples back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the samples from the magnet and resuspend each pellet in 16 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove eluate once it is clear and colourless. Transfer each eluted sample to a new tube or plate well.

Quantify 1 µl of end-prepped DNA using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward the end-prepped DNA into the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

4. Ligation of Barcode Adapter

Material

Consumibles

Instrumental

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice: