Direct RNA sequencing - sequence-specific (SQK-RNA004)

Oxford Nanopore Technologies
Document type icon

MinION: Protocol

Direct RNA sequencing - sequence-specific (SQK-RNA004) V DSS_9197_v4_revB_20Sep2023

This protocol:

  • is for selecting RNA targets of your choice for sequencing native RNA.
  • uses total RNA as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

This protocol:

  • is for selecting RNA targets of your choice for sequencing native RNA.
  • uses total RNA as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Document version: DSS_9197_v4_revB_20Sep2023

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

Este es un producto de acceso anticipado

Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de productos.

Procure usar siempre la versión más reciente del protocolo.

Características del kit Direct RNA Sequencing Kit

Este kit se recomienda a usuarios que:

  • Estén explorando características del ARN como bases modificadas.
  • A los que les gustaría eliminar sesgos creados por la retrotranscriptasa o la PCR.
  • Tienen transcritos que son difíciles de retrotranscribir.

Introduction to the sequence-specific Direct RNA Sequencing protocol

This protocol describes how to carry out sequence-specific sequencing of native RNA using the Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004). Starting from total RNA, a second complementary cDNA strand is synthesised for stability by reverse transcription with a custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter. Sequencing adapters are then attached to the RNA-cDNA hybrid for sequencing on either MinION or PromethION RNA Flow Cells (FLO-MIN004RA / FLO-PRO004RA respectively). Please note, the complementary cDNA strand is not sequenced, but improves the RNA sequencing output.

This protocol is designed for sequencing specific RNA (e.g. 16 rRNA) but cannot target specific mRNA of interest. To proceed with this protocol, you will need to order custom oligos, including one that is complementary to the 3' end of the target RNA sequence. These oligos will replace the Reverse Transcription Adapter (RTA) normally used for direct RNA sequencing. For further information on how to design custom RTA, please see the Equipment and Consumables section. Below are the oligo sequences required, with the RNA 3' end-specific sequences in parenthesis:

Oligo A: 5’- /5PHOS/GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC
Oligo B: 5’-GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCC(TTTTTTTTTT)

We recommend a control experiment using the RNA Control Strand (RCS) is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your RNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell(s) to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
Reverse transcription Synthesise the complementary strand of the RNA with your custom-ordered adapter ~85 minutes At this stage the RT-RNA can be stored at -80°C for later use.

Please note, this is the only pause point in this protocol.
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the RNA-cDNA hybrid ends 45 minutes Attach sequencing adapters to the ends of the RNA-cDNA hybrid.

We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Sequence specific RNA004 workflow resize

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads
IMPORTANTE

A diferencia del ADN, el ARN se transloca a través del nanoporo en dirección 3'-5'. Sin embargo, los algoritmos de identificación de bases invierten los datos automáticamente y las lecturas se muestran en dirección 5'-3'.

IMPORTANTE

Compatibilidad del protocolo

Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:

2. Equipment and consumables

Material
  • 1 µg of total RNA in 8.5 µl
  • Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter
  • Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)
Consumibles
  • Induro® Reverse Transcriptase (NEB, M0681)
  • 10 mM de solución dNTP (p. ej. NEB, N0447)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, M0202M)
  • Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
  • Microesferas Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter™, A63987)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
  • Qubit 1x dsDNA BR Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q33265)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Termociclador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)

For this protocol, you will need 1 µg of total RNA in 8.5 µl

Muestra inicial de ARN

Es importante que la muestra inicial de ARN posea la cantidad y calidad requerida. Usar demasiado ARN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado o que contenga contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Input DNA/RNA QC.

Para más información sobre cómo utilizar ARN como muestra inicial, consulte los enlaces a continuación.

Estos documentos pueden encontrarse en la página DNA/RNA Handling page.

Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter sequence

The Reverse Transcription Adapter (RTA) supplied in the Direct RNA Sequencing kit is designed to ligate to any RNA with a poly(A) tail. However, users can customise their own RTA to target a specific RNA via the 3' end (for example, to only ligate to 16S rRNA). It is important to note that custom RTA can only target the 3’ end of RNA and cannot be used to enriched specific RNA with a poly(A) tail, see the picture below for more details.

RNA004 sequence specific ligation cartoon

To perform this protocol, you will need to order oligo A and a specific version of oligo B. In oligo B you will need to replace the 10(T) sequence with 10 bases complementary to the 3' end of your target RNA sequence. Both oligo A and oligo B are DNA.

Anneal oligo A and oligo B 1:1 at 1.4 µM in buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl) by heating to 95º C for 2 minutes and letting them cool down slowly (0.1º C/sec). This directly replaces RTA in the protocol.

Custom RTA

Sequences:
Oligo A: 5’- /5PHOS/GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC
Oligo B: 5’-GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCC(TTTTTTTTTT)

Replace the 10(T) sequence with 10 bases complementary to the 3' end of your target RNA sequence. All oligos should be HPLC purified.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

Contenido del kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004):

SQK-RNA004 tubes LH edit

Nombre Sigla Color del tapón No. de viales Volumen (μl)
RT Adapter RTA Azul 1 10
RNA Ligation Adapter RLA Verde 1 45
RNA CS RCS Amarillo 1 25
Wash Buffer WSB Naranja 2 1 200
RNA Elution Buffer REB Negro 1 300
Library Solution LIS tapón blanco, etiqueta rosa 1 600
Sequencing Buffer SB Rojo 1 700
RNA Flush Tether RFT Rosa 1 200
Flow Cell Flush FCF Blanco 1 8 000

Nota: El RNA CS (RCS) es la cadena de calibración y contiene enolasa II, del gen YHR174W, extraído de la levadura saccharomyces cerevisiae. Los archivos de referencia FASTA, correspondientes a las levaduras, están disponibles aquí.

3. Library preparation

Material
  • 1 µg of total RNA in 8.5 µl
  • Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter
  • Wash Buffer (WSB)
  • RNA Ligation Adapter (RLA)
  • RNA Elution Buffer (REB)
Consumibles
  • Microesferas Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter™, A63987)
  • Induro Reverse Transcriptase y 5 Induro RT Reaction Buffer (NEB, M0681)
  • 10 mM de solución dNTP (p. ej. NEB, N0447)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, M0202M)
  • Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Termociclador
  • Gradilla magnética
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Cubeta con hielo
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2

Preparar los reactivos NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer y T4 DNA Ligase de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y colocar en hielo:

  1. Descongelar los reactivos a temperatura ambiente.

  2. Centrifugar los viales durante 5 segundos.

  3. Mezclar los reactivos con la pipeta completamente, al menos 10 veces. Note: NO mezclar en vórtex la T4 DNA Ligase.

El tampón, NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer, quizás tenga un poco de precipitado. Dejar que alcance la temperatura ambiente y mezclar con la pipeta varias veces para romper el precipitado; agitar en vórtex durante varios segundos hasta tener la certeza de que el reactivo está completamente mezclado.

IMPORTANTE

En este protocolo, no recomendamos usar Quick T4 Ligase. Hemos descubierto que la ligasa T4 DNA Ligase (2M U/ml NEB M0202M) funciona mejor. Debe utilizarse junto al reactivo Quick Ligation Reaction Buffer (NEB B6058).

Spin down the custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter and RNA Ligation Adapter (RLA), pipette mix and place on ice.

Descongelar a temperatura ambiente los tampones Wash Buffer (WSB) y RNA Elution Buffer (REB) y mezclar en vórtex. Centrifugar brevemente y poner en hielo.

Prepare the RNA in nuclease-free water:

  • Transfer 1 µg of total RNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 8.5 μl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, combine the reagents in the following order:

Reagent Volume
RNA 8.5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3 µl
Murine RNase Inhibitor 1 µl
Custom-ordered reverse transcription adapter 1 µl
T4 DNA Ligase 1.5 µl
Total 15 µl

Mezclar con la pipeta y centrifugar brevemente.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

En un tubo nuevo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml, combinar los siguientes reactivos para obtener la mezcla de reacción de transcripción inversa:

Reactivo Volumen
Agua sin nucleasas 13 µl
10 mM de dNTPs 2 µl
5 tampón de reacción Induro RT 8 µl
Total 23 µl

Transferir la mezcla de reacción con la transcriptasa inversa al tubo de PCR de 0,2 ml, que contiene el ARN ligado con adaptador y mezclar con la pipeta.

Añadir 2 μl de Induro Reverse Transcriptase a la reacción y meclar con la pipeta.

Colocar el tubo en el termociclador e incubar a 60 °C durante 30 min, a 70 °C durante 10 min y poner a 4 °C antes de proceder con el paso siguiente.

Transferir la muestra a un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind.

Resuspender las microesferas Agencourt RNAClean XP agitando en vórtex.

Añadir 72 μl de microesferas resuspendidas Agencourt RNAClean XP, a la reacción de transcripción inversa y mezclar con la pipeta.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 200 µl de etanol al 70 %, con agua sin nucleasas.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Sin retirar el tubo del imán, lavar las microesferas con 150 μl de etanol al 70 % recién preparado, tal y como se describe a continuación:

  1. Añadir 150 µl de etanol al 70 %, recién preparado, y esperar a que las microesferas se desplacen hacia el imán y formen un precipitado.
  2. Girar el tubo 180 °C. Esperar a que las microesferas se desplacen hacia el imán y formen un precipitado.
  3. Girar el tubo 180 °C de nuevo (hasta el punto de partida) y esperar a que las microesferas precipiten de nuevo.

Retirar cuidadosamente el etanol con una pipeta y desechar.

Centrifugar brevemente y poner el tubo de nuevo en el imán hasta que el eluído esté claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 23 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 23 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

MEDIDA OPCIONAL

En este momento, la muestra de ARN-RT puede guardarse a -80 °C y utilizarse más adelante.

Nótese, en este protocolo, este es el único punto donde es posible hacer una pausa.

En el mismo tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, combinar los reactivos en el siguiente orden:

Reactivo Volumen
Muestra ARN-RT 23 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 8 µl
RNA Ligation Adapter (RLA) 6 µl
T4 DNA Ligase 3 µl
Total 40 µl

Mezclar con la pipeta.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender las microesferas Agencourt RNAClean XP agitando en vórtex.

Añadir 16 μl de microesferas resuspendidas Agencourt RNAClean XP, a la reacción de transcripción inversa y mezclar con la pipeta.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar brevemente la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán durante 5 minutos y cuando el sobrenadante esté claro e incoloro, retirarlo con una pipeta.

Añadir 150 μl de Wash Buffer (WSB) a las microesferas. Cerrar la tapa del tubo y resuspender las microesferas golpeando suavemente el tubo con el dedo. Volver a colocar el tubo en el imán, dejar que las microesferas precipiten durante 5 minutos y cuando el sobrenadante esté claro e incoloro, retirarlo con una pipeta.

Repetir el paso anterior.

IMPORTANTE

Al agitar las microesferas se obtiene una eliminación más eficaz del adaptador que al añadir el tampón y aspirarlo inmediatamente.

Centrifugar brevemente el tubo y volver a colocarlo en la gradilla magnética hasta que las microesferas hayan precipitado. A continuación, retirar cualquier resto de Wash Buffer (WSB) con la pipeta.

Retirar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 13 μl de RNA Elution Buffer (REB), golpeando suavemente el tubo con el dedo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán durante 5 minutos, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 13 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Cuantificar 1 μl de ARN retrotranscrito y adaptado, con ayuda del ensayo de ADN HS y el fluorímetro qubit.

La cantidad de eluido final que se desea recuperar es > 30 ng.

Las cantidades recogidas varían según las diferentes cantidades de muestra y las preparaciones de bibliotecas. No obstante, recomendamos utilizar el volumen completo de ARN para obtener los mejores resultados en la secuenciación.

FIN DEL PROCESO

El ARN retranscrito y adaptado está listo para cargar la celda de flujo.

IMPORTANTE

La biblioteca de ARN debe secuenciarse inmediatamente y no se puede guardar para utilizarse más adelante.

4. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION

Material
  • Library Solution (LIS)
  • Sequencing Buffer (SB)
  • RNA Flush Tether (RFT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo para ARN (FLO-MIN004RA).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Solution (LIS), RNA Flush Tether (RFT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind mezclar los siguientes reactivos. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.

Reactivos Volumen por celda de flujo
RNA Flush Tether (RFT) 30 µl
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Total 1 200 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

En un tubo de 1,5 ml preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Solution (LIS) 25,5 µl
Biblioteca de ARN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

5. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.

6. Reutilización y devoluciones de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) or Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
IMPORTANTE

El kit Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004 or EXP-WSH004-XL) es compatible con las celdas de flujo de ARN y el kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004).

No obstante, tenga en cuenta que:

  • El kit de lavado no es eficaz como enjuague de nucleasas en la secuenciación directa de ARN: no recuperará los poros bloqueados.
  • Funciona como un enjuague para cargar una muestra nueva: lavará la mayor parte de la biblioteca de la matriz y eliminará el adaptador de la muestra restante, evitando su captura y secuenciación, lo que permitirá volver a cargar la biblioteca.

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

7. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

8. Problemas durante la extracción de ARN y preparación de la biblioteca

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones Possibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel) El ARN se degradó durante la extracción. Probar un método de extracción de ARN diferente. Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el ambiente en el que se trabaje, incluido el instrumental de laboratorio, estén libres de ribonucleasas.

9. Problemas durante la secuenciación de ARN

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras la evaluación de la celda de flujo

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de cebarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, las burbujas de aire pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar a colocarla en una posición diferente (GridION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca puede haber dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad (CC) de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada, tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poros por debajo del 40 %

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poros inferior al 40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procure cargar la cantidad de biblioteca de buena calidad recomendada en la preparación de la biblioteca del protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular los moles con herramientas como la calculadora NEBio, opción "RNA ss: mass to moles".
Ocupación de los poros próxima a 0 No hay anclaje en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT) No olvide añadir Flow Cell Tether (FCT) al Flow Cell Flush (FCF) antes del cebado.

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o poros no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están irreversiblemente dañados) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de manera irreversible. Vea el vídeo Priming and loading your flow cell para familiarizarse con las técnicas más adecuadas.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 7/31/2024

Document options

MinION