PromethION: Protocol

Pharmacogenomic (PGx) sequencing workflow with adaptive sampling (blood, cells, saliva) V PGXA_9225_v114_revE_17Aug2026

This protocol provides an end-to-end workflow for the analysis of pharmacogenomic (PGx) genes using adaptive sampling, and the Oxford Nanopore platform. Downstream variant calling is via the EPI2ME™ wf-pgx workflow, acquiring a minimum of 40x coverage per sample, across the PGx-associated genes. The protocol covers genomic DNA extraction, mechanical shearing, native barcoding, library preparation, sequencing, and data analysis. It supports the multiplexing of up to four samples per PromethION™ Flow Cell and is compatible with DNA extracted from human whole blood, cultured cells, or saliva.

本实验指南具有以下特点：

Uses genomic DNA extracted from human whole blood, cultured cells, or saliva
Requires DNA fragmentation
Uses the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
Is compatible with R10.4.1 flow cells
Allows the analysis of data using the wf-pgx workflow in EPI2ME

For Research use only

FOR RESEARCH USE ONLY.

概览

本实验指南具有以下特点：

Uses genomic DNA extracted from human whole blood, cultured cells, or saliva
Requires DNA fragmentation
Uses the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
Is compatible with R10.4.1 flow cells
Allows the analysis of data using the wf-pgx workflow in EPI2ME

For Research use only

Document version: PGXA_9225_v114_revE_17Aug2026

1. 实验方案概览

本品为早期试用设备。

如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅本文了解产品的不同发布阶段。

请确保您始终使用本方案的最新版本。

This protocol outlines a streamlined, end-to-end approach for PGx sequencing using adaptive sampling, and the Oxford Nanopore platform.

Sequencing is performed over 72 hours to ensure sufficient coverage across target regions. To sustain performance and throughput, two flow cell washes and reloads are scheduled once every 24 hours for a total of three loading events during the run.

测序工作流程：

下表概述了文库制备所需的步骤，包括时间安排和可以中止的节点。

下表概述了该工作流程所需的各个步骤，包括四个样本的处理时间以及可暂停（停止）操作的节点。

样本制备、建库及测序

实验步骤	流程	时间	中止节点
样本制备	从样本中提取 gDNA 并定量。将 gDNA 片段化并定量。	3 到 4 小时	此时，可将提取的 gDNA 或片段化后的 gDNA 于 –20°C 保存，以备后续使用。修复DNA，并对DNA进行末端修复以便与接头连接。 Ligate the native barcodes to the DNA ends. Ligate sequencing adapters to the DNA ends.
测序芯片的预处理及上样	对测序芯片进行预处理，然后将制备好的文库加至芯片中进行测序。清洗测序芯片并再次上样（x2) 。	~每张测序芯片 10 分钟 60 分钟（x2)

实验准备

您将需要：

Have the correct consumables, kits, and equipment for DNA extraction, fragmentation, size selection (for saliva samples), and sequencing. This will include third-party reagents.
下载数据收集和分析软件。
检查您的测序芯片上有足够的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

文库制备

您将需要：

Use the recommended protocols to extract genomic DNA (gDNA) from whole blood, cultured cells, or saliva and fragment the gDNA. Perform bead-based size selection if required.

This protocol supports genomic DNA extraction from the following biological materials using these recommended kits:

样本类型	提取试剂盒
全血	Puregene Blood Kit（Qiagen，158023）
培养细胞	Puregene Cell Kit（Qiagen，158043）
唾液	GeneFix™ Saliva-Prep 2 DNA Isolation Kit（Isohelix，GSPN）

检查提取所得 DNA 的浓度、纯度和长度。 样本制备过程中的质量评估步骤对确保实验成功至关重要

文库制备

需使用免扩增条形码试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24），并按以下步骤操作：

DNA 损伤及末端修复
连接免扩增条形码
接头连接及纯化

测序和分析

您将需要：

使用 MinKNOW 软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
使用 EPI2ME™ 提供的 wf-pgx 工作流程分析数据。

数据包和工作流程设置

完成注册后，您将收到一个数据包，其中包含启动测序实验及分析测序数据所需的文件。该数据包包含本产品测序和数据分析所需的全部文件，并已针对本产品完成配置，确保各文件能够正确配合使用。有关在 EPI2ME 中安装 2ME 文件（包括使用演示数据进行测试）的方法，请参阅本指南的数据分析一节。

数据包包含：

.2ME 文件——用于在 EPI2ME 应用程序中运行 wf-pgx 工作流程。
参考基因组文件——以 FASTA 格式提供。
适应性采样 BED 文件——用于富集目标 PGx 相关区域。
样本列表示例——用于指定每个条形码对应的样本名称。

实验方案适用性

This protocol should only be used in combination with the following consumables and devices from Oxford Nanopore:

微生物扩增子条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）
R10.4.1 测序芯片（FLO-PRO114M）
测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004）
快速测序文库接头辅助扩展包 V14（EXP-RAA114）
测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）
测序芯片预处理试剂盒 V14 （EXP-FLP004）
PromethION 测序设备 - PromethION IT 配置要求文件
PromethION 2 Solo 测序设备 - PromethION 2 Solo IT 配置要求文件
PromethION 2 Integrated 测序设备 - PromethION 2 Integrated IT 配置要求文件

2. 仪器及耗材

材料

Human saliva, whole blood or cultured cells
免扩增条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）
测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）

耗材

Genefix™ Saliva DNA/RNA Collection & Stabilisation tube - 2ml (Isohelix, GFX-02)
Genefix™ Saliva-Prep 2 DNA Isolation Kit (Isohelix, GSPN)
Puregene Blood Kit (Qiagen, 158023)
Puregene Cell Kit (Qiagen, 158043)
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ dsDNA High Sensitivity Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32851)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
g-TUBE (Covaris, 520079)
NEBNext FFPE DNA 修复混合液（NEB，M6630）
NEBNext® Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
NEBNext®快速连接模块（NEB，E6056）
PromethION Flow Cell R10.4.1 (Oxford Nanopore, FLO-PRO114M)
Absolute ethanol
异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 (ThermoFisher, 10010023)
10 mM Tris HCl, pH 8
无核酸酶水（如 ThermoFisher，AM9937）
15 ml centrifuge tubes (e.g. Falcon tubes)
2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
0.2 ml 薄壁PCR管
吸水材料（如吸水纸或纸巾）

仪器

PromethION 测序设备
PromethION 测序芯片遮光片
HulaMixer™ Sample Mixer (e.g. ThermoFisher, 15920D)
适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
Centrifuge for 15 ml tubes
Benchtop microcentrifuge for 0.2 ml, 1.5 ml, and 2 ml tubes
热循环仪
Heat block
迷你离心机
涡旋混匀仪
Incubator or water bath
盛有冰的冰桶
计时器
Pipettes and tips (standard and low retention with wide bore)

可选仪器

恒温混匀仪
Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）

Input DNA

For this workflow, we recommend extracting gDNA from 2 ml of saliva, 1 ml of whole blood or 5x10⁶ cells from cultured cell lines using the recommended kits for the sample preparation step.

此外，您也可按需采用其他提取方案，但需注意，Oxford Nanopore Technologies 未对其进行验证。

For the library preparation protocol, you will need 2 µg of fragmented gDNA from each sample. Fragments below 3 kb should be less than 10% of the total DNA. Excess short fragments can compromise the success of the workflow. If it is more than 10%, then bead-based size selection should be performed as described in this protocol.

Oxford Nanopore Technologies 推荐您使用本实验指南中列出的所有第三方试剂，并已对其进行验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂。

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到 PromethION 测序芯片12周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换*：请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

测序芯片	芯片上的活性孔数确保不少于
PromethION 测序芯片	5,000

*（请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于 Oxford Nanopore Technologies 推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两日内递交给我们。）

3. Extraction of DNA from a range of biological sample types

This protocol supports three sample types for genomic DNA extraction: whole blood, cultured cells, and saliva. Each sample type requires a specific extraction method to ensure optimal DNA quality and yield. Please follow the appropriate extraction procedure for your chosen input material.

Following extraction, genomic DNA from each sample type must be mechanically sheared to ~10 kb fragment lengths using a Covaris g-TUBE. Saliva samples follow a dedicated fragmentation and clean-up procedure, including a size selection step, before continuing to library preparation. Blood and cultured cells follow a common extraction and fragmentation protocol, the fragmented DNA being carried forward directly to the library preparation step.

4. DNA extraction from saliva

材料

2 ml saliva sample in a GeneFix™ Saliva DNA/RNA Collection & Stabilisation tube (GFX-02) containing 2 ml of lysis buffer

耗材

Genefix™ Saliva-Prep 2 DNA Isolation Kit (Isohelix, GSPN)
Genefix™ Saliva DNA/RNA Collection & Stabilisation tube - 2ml (Isohelix, GFX-02)
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
15 ml centrifuge tubes (e.g. Falcon tubes)
2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

Centrifuge for 15 ml tubes
Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
Water bath set at 60°C
Heat block
涡旋混匀仪
迷你离心机
计时器
Pipettes and tips (standard and low retention with wide bore)

可选仪器

恒温混匀仪
Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）

概览

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 Extract your DNA using the Isohelix Kit. 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 Fragment your DNA using the Covaris g-TUBE., 3. Perform a bead-based size selection on the sheared sample and check its quantity, purity, and length.

请注意： It is important to remove all of the liquid supernatant.

Once the supernatants are transferred, discard the pellets.

请注意： The DNA pellet may be difficult to see at this point. Please take care when removing the supernatant. It is important to remove all of the liquid supernatant.

Alternatively, a thermomixer set at 37°C and 300 rpm can be used.

We suggest taking a reading from the top, middle and bottom of the sample tubes to test for homogeneity.

如果 Qubit 测量结果存在较大差异，可能是由于 DNA 未充分重悬混匀所致。 If this occurs, we recommend performing additional mixing/agitation steps and increasing the incubation and elution times as follows:

Mix your samples again with a wide-bore tip.
Elute your samples at 50°C for 1 hour in a thermomixer set to 300 rpm.

Expected gDNA yield from saliva

The expected yield following DNA extraction from 2 ml saliva is approximately 11–35 µg of gDNA.

The Qubit measurements should be within the range of 100–350 ng/μl.

Take forward 5 µg gDNA extracted from saliva into the DNA fragmentation step.

5. Fragmentation of saliva extracted DNA

材料

5 µg gDNA extracted from saliva

耗材

g-TUBE (Covaris, 520079)
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
迷你离心机
Pipettes and tips

可选仪器

Femto Pulse System (Agilent Technologies) or equivalent

To prepare fragmented gDNA for the library preparation protocol, mechanical fragmentation is performed using a g-TUBE (Covaris) to shear DNA to fragment lengths of approximately 10 kb.

2.目视检查，确认样品已完全从 g-TUBE 上腔流入下腔。

Expected gDNA yield following fragmentation

Sample concentration after g-TUBE shearing is expected to be within the range of 45–55 ng/µl.

Take forward 5 µg of fragmented gDNA in 100 µl, from each sample, into the bead-based size selection step. If the volume is less than 100 µl, make up to 100 µl with TE buffer.

6. Size selection of sheared DNA from saliva

材料

5 µg of fragmented gDNA in 100 µl per sample (4 samples)
AMPure XP Beads (AXP from the Native Barcoding Kit 24 V14)

耗材

Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
10 mM Tris HCl, pH 8
新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
HulaMixer™ Sample Mixer (e.g. ThermoFisher, 15920D)
适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
迷你离心机
涡旋混匀仪
Heat block
Pipettes and tips

可选仪器

恒温混匀仪

To obtain optimal material for sequencing DNA from saliva samples, size selection must be performed.

Thoroughly vortex the AMPure XP (AXP) beads for 30 seconds.
Dilute (35% v/v) of 1,750 µl of the AMPure XP (AXP) beads in 3,250 µl of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.

请注意： Ensure accurate pipetting of the correct volume of beads for the next steps, for optimal results.

Ensure that the whole volume of the solution is homogenously mixed.

Alternatively, the four tubes can be incubated in a thermomixer set at 37°C and 300 rpm.

The expected recovery should be 50% or higher.

Expected DNA yield following size selection

From 5 µg gDNA input into the size selection step, expect at least ~2.5 µg of gDNA at the end of the process.

Take forward 2 µg of fragmented, size selected gDNA in 48 µl, for each sample, into the library preparation section of this protocol.

7. DNA extraction from whole blood

材料

≥1 ml of human blood in a EDTA K2 vacuum tube

耗材

Puregene Blood Kit (Qiagen, 158023)
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
Isopropanol, 100% (Fisher Scientific, 10723124)
15 ml centrifuge tubes (e.g. Falcon tubes)
2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
吸水材料（如吸水纸或纸巾）

仪器

Centrifuge for 15 ml tubes
Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
设定为 37°C 和 50°C 的培养箱或水浴锅
涡旋混匀仪
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips (standard and low retention with wide bore)

可选仪器

恒温混匀仪

This section provides instructions for DNA extraction from human whole blood in EDTA K2 using the Puregene Blood Kit from Qiagen.

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。

The pellets should be completely dispersed. This facilitates cell lysis in the next step.

注意： 轻柔吹打 10–15 次，使细胞充分裂解，直至样品完全均一、无结块。确保溶液混合均匀。

注意： 孵育结束时，请确保溶液充分均一，且无结块残留。
您可按需使用宽口移液枪头吹打混匀，或轻柔倒转离心管以促进溶液混匀。

注意： 蛋白应形成紧实的红褐色沉淀。若蛋白沉淀不够紧实，可将离心管在冰上放置 5 分钟后重复离心。

Avoid dislodging the protein pellet when pouring.

或者，您也可使用移液枪转移上清液，操作过程中同样应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

注意： 如蛋白沉淀在任何步骤中被扰动，请重新以 2,000 × g 离心 10 分钟。请确保仅转移澄清的上清液，防止蛋白污染最终洗脱液。

DNA 可能在管底形成小的白色沉淀。

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。 A separate clean 15 ml centrifuge tube can also be used as a waste container to mitigate for any pellet loss.

注意： 上清液可通过移液或倾倒至吸水材料上去除。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。 A separate clean 2 ml tube can also be used as a waste container to mitigate for any pellet loss.

请注意： Avoid drying the pellets to the point of cracking.

注意： DNA 沉淀可能需要一定时间才能完全溶解；定量前请确保溶液已充分混匀。 Mix with a wide bore pipette tip 10–15 times, every 30 minutes, while incubating at 50°C.

Solubilisation can be aided by incubating at 50°C on a thermomixer with gentle agitation at 300 rpm or an end over end rotating mixer can be used.

可选：孵育步骤亦可在室温下过夜完成。

We suggest taking a reading from the top, middle and bottom of the sample tubes to test for homogeneity.

**请注意：**如果 Qubit 测量结果存在较大差异，可能是由于 DNA 未充分重悬混匀所致。

此时建议延长孵育时间，以促进 DNA 完全溶解。

Expected gDNA yield from whole blood

The expected yield following DNA extraction from 1 ml whole blood is approximately 15–35 µg gDNA.

The expected Qubit measurements should be within the range of 75–300 ng/μl.

Take forward 2 µg gDNA into the fragmentation section for blood and cell derived DNA.

8. DNA extraction from cultured cells

材料

5x10⁶ cells（例如细胞培养物或组织样本）

耗材

Puregene Cell Kit (Qiagen, 158043)
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 (ThermoFisher, 10010023)
15 ml centrifuge tubes (e.g. Falcon tubes)
2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
吸水材料（如吸水纸或纸巾）

仪器

Centrifuge for 15 ml tubes
Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
设定为 37°C 和 50°C 的培养箱或水浴锅
涡旋混匀仪
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips (standard and low retention with wide bore)

可选仪器

恒温混匀仪

细胞沉淀在重悬后应完全分散，以利于后续的细胞裂解步骤。

注意： 轻柔吹打 10–15 次，使细胞充分裂解，直至样品完全均一、无结块。确保溶液混合均匀。

注意： 孵育结束时，请确保溶液充分均一，且无结块残留。
您可按需使用宽口移液枪头吹打混匀，或轻柔倒转离心管以促进溶液混匀。

It is important to thoroughly vortex the entire volume in the tube, ensuring it is homogenously mixed and forming a white solution at the end of the pulse vortexes.

蛋白应形成紧实的白色沉淀。若蛋白沉淀不够紧实，可在冰上放置 5 分钟后重复离心。

请注意： It is very important to ensure that no protein pellet is carried over in the following steps.

Avoid dislodging the protein pellet when pouring.

或者，您也可使用移液枪转移上清液，操作过程中同样应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

注意： 如蛋白沉淀在任何步骤中被扰动，请重新以 2,000 × g 离心 10 分钟。请确保仅转移澄清的上清液，防止蛋白污染最终洗脱液。

DNA 可能在管底形成小的白色沉淀。

**请注意：**避免沉淀干燥至表面开裂。

Solubilisation can be aided by incubating at 50°C on a thermomixer with gentle agitation at 300 rpm or an end over end rotating mixer can be used.

可选：孵育步骤亦可在室温下过夜完成。

We suggest taking a reading from the top, middle and bottom of the sample tubes to test for homogeneity.

**请注意：**如果 Qubit 测量结果存在较大差异，可能是由于 DNA 未充分重悬混匀所致。

此时建议延长孵育时间，以促进 DNA 完全溶解。

Expected gDNA yield from cultured cells

The expected yield following DNA extraction from 5x10⁶ cells is approximately 15–35 µg gDNA.

The expected Qubit measurements should be within the range of 75–300 ng/μl.

Take forward 2 µg gDNA into the fragmentation section for blood and cell derived DNA.

9. Fragmentation of blood and cell derived DNA

材料

2 µg of extracted gDNA from blood or cultured cells

耗材

g-TUBE™（Covaris，520079）
Qubit™ dsDNA Broad Range Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32850)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) (Fisher Scientific, 10224683)
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
迷你离心机
Pipettes and tips

可选仪器

Femto Pulse System (Agilent Technologies) or equivalent

To prepare fragmented gDNA for the library preparation protocol, mechanical fragmentation is performed using a g-TUBE (Covaris) to shear DNA to fragment lengths of approximately 10 kb.

2.目视检查，确认样品已完全从 g-TUBE 上腔流入下腔。

Expected gDNA yield following fragmentation

Sample concentration after g-TUBE shearing is expected to be within the range of 38–45 ng/µl.

Take forward 2 µg of fragmented gDNA in 48 µl, for each sample, into the library preparation section of this protocol.

10. DNA损伤及末端修复

材料

每个样品需 48 µl 片段化 gDNA（2 µg）（共 4 个样品）
AMPure XP Beads (AXP from the Native Barcoding Kit 24 V14)

耗材

NEBNext FFPE DNA 修复混合液（NEB，M6630）
NEBNext® Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
Qubit™ dsDNA High Sensitivity Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32851)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
Absolute ethanol
无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
0.2 ml 薄壁PCR管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 0.2 ml, 1.5 ml, and 2 ml tubes
热循环仪
HulaMixer™ Sample Mixer (e.g. ThermoFisher, 15920D)
适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
迷你离心机
涡旋混匀仪
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips

为获得最优表现，NEB建议如下：

1.于冰上解冻所有试剂。

2.轻弹或倒转试剂管，使其充分混匀。
注意： 请勿涡旋振荡 FFPE 修复混合液或 Ultra II 末端修复酶混合物。

3.每日首次打开一管试剂前，请务必先瞬时离心。

4.Ultra II 末端修复反应缓冲液及 FFPE DNA 修复缓冲液中可能会含有少量沉淀。请待液体回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；随后涡旋振荡 30 秒，至沉淀完全溶解。
注意： 通过涡旋振荡充分混合缓冲液至关重要。

5.FFPE DNA 修复缓冲液 v2 可能呈淡黄色，此属正常现象，不影响其使用。

1.确保每个样本均已置于洁净、独立的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，样本体积为 2 µl（约含 1 µg DNA）。
Note: You should have 4 sample tubes.

2.如不足48 μl，请加入无核酸酶水补足。

3.吹打或轻弹离心管，充分混匀。

4.使用迷你离心机瞬时离心。

试剂	体积
前一步骤所得 ~2 µg 片段化 DNA	48 µl
Ultra II 末端修复反应缓冲液	3.5 µl
Ultra II 末端修复酶混合物	3 µl
NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液	3.5 µl
NEBNext FFPE DNA 修复混合液	2 µl
总体积	60 µl

请注意：请确保配制足量的 80% 乙醇，以满足所有样本的处理需求。

如果沉淀被扰动，请等待磁珠重新沉降后再吸走乙醇。

请注意：由于样本尚未添加条形码，请务必单独处理各样本。 At this stage they are not yet barcoded.

请注意： We recommend performing triplicate Qubit readings for each of the 4 samples to quantify them accurately. This will be essential for further normalising of each sample before barcoding.

The expected recovery following end-prep is 1–1.6 µg per sample.

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。1.取16 µl 产量最低的样本，转移至一支新的 0.2ml 薄壁 PCR 管中。 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。2.从其余各样本中分别取出与产量最低样本等质量的 DNA，分别加入洁净的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。 3.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。3.使用无核酸酶水将每个样本的体积补足至 16 μL。

Take forward the equimolar mass of repaired and end-prepped DNA samples in 16 µl into the native barcode ligation section. 如需要，您也可以此时将样品置于4°C储存过夜。

11. 免扩增条码连接

材料

End-prepped DNA in 16 µl from previous section (4 samples, normalised to the sample with the lowest yield)
Reagents from the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24):
免扩增条形码（NB01-24）
AMPure XP 磁珠（AXP）
短片段缓冲液（SFB）
EDTA（EDTA）

耗材

NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
Qubit™ dsDNA High Sensitivity Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32851)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
0.2 ml 薄壁PCR管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 0.2 ml, 1.5 ml, and 2 ml tubes
HulaMixer™ Sample Mixer (e.g. ThermoFisher, 15920D)
适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
涡旋混匀仪
迷你离心机
Heat block
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips

1.在室温下解冻试剂。

2.将各试剂管瞬时离心5秒。

3.用移液枪全量吹打试剂 10 次，确保充分混匀。

条形码板孔仅限单次使用。使用前请确认所选孔密封完好；一旦刺穿或开启，不得再次使用。

请注意： 每个样本应仅对应一种条形码。

试剂	体积
经过末端修复的 DNA	16 µl
免扩增条形码（NB01-24）	4 µl
Blunt/TA 连接酶预混液	20 µl
总体积	40 µl

请注意： For 4 samples, the total volume should be 176 µl.

以下纯化步骤中使用的是SFB（短片段缓冲液）而非80%的乙醇来洗涤磁珠。使用乙醇会严重破坏测序反应。

在条形码连接步骤完成后，预期可回收约 2.2–3.2 µg 的 DNA。

带条形码的 DNA 样本将用于稍后的接头连接及纯化步骤。如需要，您也可以此时将样品置于4°C储存过夜。

12. 接头连接及纯化

材料

Reagents from the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24):
长片段缓冲液（LFB）
洗脱缓冲液（EB）
免扩增接头（NA）
AMPure XP 磁珠（AXP）

耗材

NEBNext®快速连接模块（NEB，E6056）
Qubit™ dsDNA High Sensitivity Quantitation Assay (ThermoFisher, Q32851)
Qubit™ 分析管（ThermoFisher，Q32856）
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

Benchtop microcentrifuge for 1.5 ml, and 2 ml tubes
HulaMixer™ Sample Mixer (e.g. ThermoFisher, 15920D)
适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
Qubit™ Flex Fluorometer (ThermoFisher)
热循环仪
迷你离心机
涡旋混匀仪
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips

本试剂盒及其实验指南中使用的快速测序文库接头（NA）不可与其他测序接头互换使用。

测序芯片质检

我们强烈建议在开始文库制备之前，对测序芯片的活性纳米孔数量进行质检，以确保其足够支持实验的顺利进行。

详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的测序芯片质检说明。

1.室温下解冻

2.将各试剂管瞬时离心5秒。

3.用移液枪全量吹打试剂 10 次，确保充分混匀。

注意： 请勿涡旋振荡快速 T4 DNA 连接酶。

NEBNext 快速连接反应缓冲液（5X）可能会出现少量沉淀。请待液体回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后涡旋振荡数秒，确保充分混匀。

请勿涡旋震荡快速 T4 DNA 连接酶。

|试剂体积| | --- | --- | |合并后的带条码样本 |30 µl| |免扩增接头（NA） |5 µl| |NEBNext 快速连接反应缓冲液（5X） |10 µl| |快速 T4 DNA 连接酶 |5 µl| | 总体积 | 50 µl |

请注意： 吸取上清液时请谨慎操作，由于缓冲液黏度较高，可能会将磁珠一同吸出。

将磁珠丢弃。

在接头连接及纯化步骤完成后，预期可在 96 µl 的体积中回收约 1–1.2 µg 的 DNA。

构建好的文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上或4℃条件下保存。

文库保存建议

若为短期保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf DNA LoBind 离心管中 4℃ 保存。若为一次性使用且储存时长 超过3个月 ，我们建议将文库置于Eppendorf DNA LoBind 离心管中 -80℃ 保存。

13. PromethION测序芯片的预处理及上样

材料

Reagents from the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24):
测序缓冲液（SB）
文库颗粒（LIB）
测序芯片系绳（FCT）
Flow Cell Flush (FCF)

耗材

PromethION 测序芯片
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

PromethION 测序设备
PromethION 测序芯片遮光片
迷你离心机
涡旋混匀仪
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips

Sequencing is performed over 72 hours to ensure sufficient coverage across target regions. To sustain performance and throughput, two flow cell washes and reloads are scheduled for once every 24 hours, for a total of three loading events during the run.

本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-PRO114M）。

测序芯片的预处理及上样

我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

将芯片从冰箱中取出后，请将其置于室温环境孵育 20 分钟再插入 PromethION 测序仪。潮湿环境下的测序芯片上可能会形成冷凝水。因此，请检查测序芯片顶部和底部的金色连接器引脚处是否有水凝结。如有，请使用无绒布擦干。请确保测序芯片的底部有热垫（黑色）覆盖。

请根据待上样测序芯片的数量，另拿一支适当体积的离心管，按下表制备测序芯片预处理液。

试剂	体积（每张芯片）
测序芯片冲洗液 (FCF)	1,170 µl
测序芯片系绳（FCT）	30 µl
总体积	1,200 µl

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将测序芯片平放在金属板上。

2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将测序芯片推入对接端口，直至金色引脚或绿色电路板不可见。

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将测序芯片与连接器横竖对齐，以便顺利卡入。 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。用力下压芯片至卡槽，并确认卡夹位置归位。

如插入测序芯片的角度出现偏差，可能会损坏 PromethION 上的引脚并影响测序结果。如您发现 PromethION 测序仪芯片卡槽上的引脚损坏，请通过电子邮件（support@nanoporetech.com）联系我们的技术支持团队。

请在文库上样前完成测序芯片质检，评估可用的活性纳米孔数量。

若该测序芯片此前已完成质检，则可跳过此步骤。

详细操作说明请参阅 MinKNOW 实验指南中的测序芯片质检说明部分。

小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将枪头垂直插入加液孔中。 3.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在 220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。

LIB管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。

试剂	每张测序芯片的上样体积
测序缓冲液（SB）	100 µl
文库颗粒 (LIB)，使用前充分混匀；或文库溶液 (LIS)	68 µl
DNA 文库	32 µl
总体积	200 µl

请注意： 为提高纳米孔阵列的覆盖度，已适当增加文库上样体积。在上样前，请将文库置于冰上或4℃条件下保存。

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在文库加样至测序芯片后（包括芯片清洗并重新加样时），将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。确保遮光片的前沿位于测序芯片ID的上方。 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。用力下压遮光片的卡垫部分，遮光片空槽边缘会随卡垫卡入加液孔孔盖下方。

准备就绪后，合上 PromethION 设备上盖。

请在为 PromethION 芯片上样后，等待 10 分钟再启动实验，以提高芯片产出。

For instructions on setting up your sequencing run, please refer to the Data acquisition and basecalling section of this protocol.

Reminder: For this protocol, we recommend washing and reloading your flow cell with fresh library to maintain high data acquisition after ~24 hours of sequencing.

Follow the instructions in the Washing and reloading a PromethION Flow Cell section of this protocol.

14. PromethION测序芯片的预处理及上样

材料

之前步骤获得的已连接接头的 DNA 文库
测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）

耗材

1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

仪器

迷你离心机
涡旋混匀仪
计时器
盛有冰的冰桶
Pipettes and tips

我们建议在测序约 24 小时后对测序芯片进行清洗并重新上样。

本方法建议在测序约 24 小时后对芯片进行首次清洗，以恢复纳米孔活性并维持高效的数据采集。再经过约 24 小时测序后，应进行第二次清洗并重新上样。接头连接步骤中已预先制备足够的文库，以满足三次芯片上样的需求。

此清洗步骤旨在去除测序芯片内现存的大部分文库并疏通纳米孔，为芯片的下一次上样做好准备。
请在清洗及上样过程中暂停 MinKNOW 的数据采集。
测序芯片经清洗后，即可用于下一文库的上样。

下图展示了测序芯片在清洗前后纳米孔状态的示例数据，以及包含清洗和重新上样步骤的累计测序数据产出示例。红色星号标示了执行测序芯片清洗与重新上样的时间点。

图 1. 96 小时测序过程中的通道状态变化。通过对测序芯片进行清洗，可恢复被堵塞的纳米孔，从而实现连续高效的数据采集。红色星号表示执行冲洗的时间点。

PromethION 测序芯片的清洗与重新上样视频

以下视频演示了如何在测序运行结束后清洗测序芯片并上样新的文库。

如您计划在清洗后立即进行下一次文库上样，建议在清洗过程中保留测序芯片的遮光片。

若芯片在清洗后需暂时保存，则可将遮光片移除。

试剂	体积（每张芯片）
清洗混合液（WMX）	2 μl
清洗稀释液（DIL）	398 μl
总体积l	400 μl

在吸出废液前，请确保加液孔已关闭，以避免气泡进入传感器阵列，造成大量测序通道损失。

1.合上加液孔孔盖。 2.将 P1000 移液枪插入废液口，吸出废液。

注意： 由于加液孔已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。

小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

1.将P1000移液枪转至200µl刻度。 2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。将枪头垂直插入加液孔中。 3.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。

1.使用P1000移液枪吸取200 µl测序芯片清洗混合液。 2.2.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪头没有气泡。 3.缓慢转动移液枪的量程调节齿轮（若移液枪具备该功能），将预处理液加入测序芯片；或 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。 4.设置计时器，孵育 5 分钟。

1.使用 P1000 移液枪吸取 200 µl 测序芯片清洗混合液。 2.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪头没有气泡。 3.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。缓慢转动移液枪的量程调节齿轮（若移液枪具备该功能），将预处理液加入测序芯片；或 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。

在吸出废液前，请确保加液孔已关闭，以避免气泡进入传感器阵列，造成大量测序通道损失。

1.确保加液孔孔盖已关闭。 2.将 P1000 移液枪插入废液口，吸出废液。

注意： 由于加液孔已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。

本节中使用的缓冲液不支持芯片质检。 However, number of available pores will be reported after the next pore scan.

执行两次“PromethION 测序芯片清洗与重新上样” 操作，共完成三次文库上样（即初始上样 + 两次清洗与重新上样），以最大化数据产出。

第一次清洗与重新上样应在测序约 24 小时时进行。
第二次清洗与重新上样应在测序约 48 小时时进行。

15. 数据采集和碱基识别

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started in MinKNOW.

MinKNOW 提供两种启动测序实验的方法：

直接启动测序实验（不使用样本列表）：输出文件将使用默认的条形码 ID 命名（如 barcode01、barcode02）；

通过样本列表启动测序实验：您可以在样本列表的 alias 列中，为每个条形码指定自定义样本别名。输出文件将以该别名命名，从而提高样本的可追溯性。下文将分别介绍这两种启动方式的操作步骤。

在 MinKNOW 中启动测序实验（不使用样本列表）

1.在 "开始 "（Start）页面上，选择 开始测序 （Start Sequencing）。

2.输入实验名称（ experiment name）、样本编号（sample ID），从下拉菜单中选择测序芯片的类型。

3.选择试剂盒：免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24）

4.启用（ON）碱基识别（Basecalling），并使用高精准（HAC）模型（默认设置）。启用（ON）条码拆分（Barcoding，使用任何条形码试剂盒时默认启用）。启用（ON）适应性采样（Adaptive Sampling）。

5.选择富集（Enrich）模式，并启用“仅对目标区域进行碱基识别”（Basecall on-target reads only）选项。然后使用数据包中提供的 PGx BED 文件 和 参考基因组 文件。 These files are specifically configured for PGx enrichment. Using alternative BED or reference files may result in inconsistent results.

6.将输出格式设置为 BAM，并将输出频率设置为 每 10 分钟 。

7.保持 **比对“（Alignment）功能为”关闭“（OFF）状态。

8.继续至参数确认页面，然后点击“Start”（开始）启动测序实验。

在 MinKNOW 中通过样本列表启动测序实验

1.在”开始“（Start）菜单中选择 通过样本列表启动测序实验 （Start from a sample sheet）。

当在 MinKNOW 中使用样本列表启动测序实验时，您需要上传一个包含样本信息的 CSV 文件。该文件必须符合下表规定的格式。样本列表中的每一行对应一个带条形码的样本，所有列标题均须使用小写字母，且必须与下表保持一致。

上传后，MinKNOW 会自动检查样本列表是否有误。若未检测到任何错误，单击 Continue （继续），即可进入测序设置。

样本列表列名	说明
flow_cell_id	所用测序芯片的 ID（例如 SIM72476），必须对应当前设备上的测序芯片。
flow_cell_product_code	测序芯片的产品代码（例如 FLO-PRO114M）。
kit	所用文库制备试剂盒的名称（例如 SQK-NBD114-24）。
sample_id	样本或样本池的名称或编号（例如 pgx_1）。
experiment_id	实验名称或编号，用于实验分组或追踪。
barcode	与样本对应的条形码（例如 barcode01），必须属于所使用的条形码试剂盒。
alias	用户自定义的名称，在输出文件中将替代条形码 ID（例如 test1）。名称长度必须为 1–40 个字符，且只能包含字母、数字、连字符（-）或下划线（_）。“unclassified”、“classified” 和 “mixed” 为保留名称，不可使用。

Once the sample sheet is validated and accepted, proceed to the Run Configuration screen as shown below.

5.选择富集（Enrich）模式，并启用“仅对目标区域进行碱基识别”（Basecall on-target reads only）选项。 Then use the PGx BED file and reference genome provided in the data bundle. These files are specifically configured for PGx enrichment. Using alternative BED or reference files may result in inconsistent results.

6.将输出格式设置为 BAM，并将输出频率设置为 每 10 分钟 。

7.保持 **比对“（Alignment）功能为”关闭“（OFF）状态。

8.继续至参数确认页面，然后点击“Start”（开始）启动测序实验。

16. Data analysis using the wf-pgx workflow

PromethION 24/48 and PromethION 2 Integrated (P2i) devices are compatible with the computational requirements of the analysis. This also includes the PromethION 2 Solo device connected to a GridION.

If you are running this analysis on an integrated sequencing device (e.g. PromethION 24/48 or P2i), do not run while sequencing. The analysis may interfere with active sequencing runs.

Alternatively, if you are running the analysis on a dedicated computer and not on an Oxford Nanopore device, the following characteristics are required for your computer.

	最低配置	推荐配置
CPU 核心数	8	16
内存	32 GB	64 GB
操作系统	Linux/Windows/macOS	Linux/Windows/macOS
存储空间	500 GB	500 GB

软件要求

EPI2ME Desktop

This analysis requires the EPI2ME desktop application version 5.2.5 or newer, which can be downloaded. The detailed steps for the installation depend on the operating system. Please follow the corresponding installation instructions.

**1.**安装完成后，请按下图所示，在主控制面板中单击 “Settings”（设置），并将工作目录设置为 ‘/data/epi2melabs‘。这样可避免分析过程中生成的文件占用系统主目录（home directory）的存储空间。

The analysis pipeline is distributed as a 2ME file, which contains all the necessary docker images and reference genome to run the analysis pipeline.

2.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 To install the pipeline, go to the Launch menu.

3.选择 Import workflow（导入工作流程）选项。

4.点击文件夹图标，选择 .2ME 文件，然后点击“Install”（安装）。

To validate the installation, we recommend launching a demo run. It will require internet access to download two small BAM files which will automatically download the data and execute the pipeline.

5.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 To launch the demo, select Options and in the drop-down menu, select Run demo analysis.

6.运行成功后，会显示一个标有“Completed”（完成）的绿色标识。

Analysis input

The input for wf-pgx is a directory containing one sub-directory per sample with BAM or FASTQ files corresponding to the same sample. Importantly, the name of the sample directory will be used to assign sample name either directly or by matching the directory name to the alias through a CSV spreadsheet.

Input BAMs files can be unaligned, in which case wf-pgx will align them. If BAM files are aligned to a reference genome other than the one provided as part of the data bundle, the sequences will be realigned by wf-pgx.

分析

Launch the pipeline by selecting it from the Launch menu.

Then click on the blue Launch tab.

Data is provided under the Bam option which can be navigated through by selecting the directory containing all the sample data directories.

Select the Enrichment method used to generate the data: 适应性采样（AS）。

5.点击“Launch workflow”（启动工作流程）。 By default, it restricts the analysis to regions targeted in the PGx BED file provided.

The workflow will indicate the status of the analysis as it progresses. Once completed, it will indicate as Completed with a green badge as shown below. Some of the analysis results will be available only after the workflow is completed.

Analysis results

Once the analysis is completed, you can explore an overview of the run by navigating to the Reports section.

报告包含以下七个部分，各部分简介如下：

1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 Sample Metadata - indicates the correspondence between the sample name and the barcode it was associated with. The data for each sample is found in its corresponding tab.

Genotyped positions statistics - summary of SNPs and indels found at the targeted regions. The number of records corresponds to the total number of base pairs genotyped. The no-ALTs correspond to positions genotyped which have no variants.

Chinook - Table of CYP2D6 diplotypes identified per sample by Chinook, the Oxford Nanopore targeted caller.

PharmCAT Coverage - summary of coverage at positions relevant for PharmCAT star allele calling. It also includes a subsection for exploring specific positions per sample in more detail.

This section also explores positions which had coverage below 30X.

Software versions - versions of the tools used for the analysis.
Workflow parameters - what options were user-defined or set as default, during this analysis.

7.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。 About this report - disclaimer about the use of this report as well as the version of wf-pgx used.

The files resulting from the analysis can be explored through the Files tab.

Alternatively, the resulting files can be navigated through directly in the local file manager by selecting Open folder under the Options menu.

工作流程输出：

文件	说明
software_versions.txt	列出工作流程运行过程中使用的主要软件工具版本，可用于调试和结果复现。
wf-pgx-report.html	HTML 格式的分析报告，包含测序统计信息。
sample/	Directory containing sample specific results including variant calls, PGx predictions, and intermediate analysis files.
sample/sample.filtered.vcf.gz	Compressed VCF file with filtered variant calls for this sample. Contains relevant variants post-depth and allele frequency filters.
sample/sample.filtered.vcf.gz.tbi	Index file for the filtered VCF, used for fast querying by tools like bcftools or IGV.
sample/sample.haplotagged.bam	BAM file where each read has been tagged with its inferred haplotype. This includes all the content from tagged.bam from Chinook and the rest of the genome. Useful for downstream phasing-aware analysis and visualisation.
sample/sample.haplotagged.bam.bai	sample.haplotagged.bam 的索引文件。
sample/sample.match.json	包含 PharmCAT 样本等位基因匹配结果的 JSON 文件。
sample/sample.pharmcat.tsv	Tab-separated file summarising PharmCAT output for this sample, including diplotypes, haplotypes, and relevant variant information but without phenotypes or recommendations.
sample/pharmcat.log	PharmCAT 日志，记录 wf-pgx 工作流程运行过程中的执行信息。
CYP2D6/	Directory with detailed results from Chinook analysis for the CYP2D6 gene.
CYP2D6/chinook.log	Chinook operation logs.
CYP2D6/consensus.fasta	Contains the assembled sequences for both CYP2D6 and CYP2D7 gene alleles that Chinook was able to reconstruct.
CYP2D6/diplotype_structure.out	Structure of the predicted CYP2D6 diplotype based on reconstructed alleles from consensus.fasta. Tandem repeats are represented with '+'.
CYP2D6/report.tsv	Tab-separated file with CYP2D6 diplotype report.
CYP2D6/summary.out	Contains diplotype in star allele format (e.g. 1/68+*4), following PharmVar standards.
CYP2D6/tagged.bam	BAM file with retained reads from CYP2D6/CYP2D7 region, including tags indicating allele assignment, ‘XA’, and ‘sv’ for reads supporting the presence of tandem copies.
CYP2D6/tagged.bam.bai	tagged.bam 的索引文件。
execution/	由 Nextflow 生成的目录，包含工作流程执行报告和运行元数据。
execution/report.html	Nextflow 执行报告，汇总各个流程（process）的执行时间、资源使用情况及缓存信息。
execution/timeline.html	工作流程执行时间线，显示各个流程的运行时间，可用于分析运行瓶颈。
execution/trace.txt	记录所有 Nextflow 进程的详细执行信息，包括开始和结束时间、资源使用情况以及工作目录。
igv.json	用于配置 IGV 的 JSON 文件，可在 IGV 中查看样本的比对结果和变异信息。
params.json	记录工作流程运行时使用的参数，以便复现分析过程。

17. 测序芯片的重复利用及回收

采用本方法完成实验后，不建议清洗并重复使用测序芯片。

由于本实验测序时间较长，且需多次清洗测序芯片并重新上样，因此不建议在实验完成后重复使用该测序芯片，

以免数据产出不足，无法满足后续分析需求。

您可在此处找到回收测序芯片的说明。

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南中“疑难解答指南”一节。

18. DNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

低质量样本

低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8， 260/230 <2.0-2.2）。用户所使用的DNA提取方法未能达到所需纯度。您可在“污染物”专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

请考虑将样品再次用磁珠纯化。 |

经AMPure磁珠纯化后的DNA回收率低

现象	可能原因	措施及备注
低回收率	AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失	1. ### 1.EPI2ME 工作流程
Oxford Nanopore Technologies 通过 EPI2ME 平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。AMPure 磁珠沉降速度较快，因此在将磁珠加入样品前，请务必充分重悬混匀。 2. 2.当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。 DNA片段短于预期 AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，据此计算出合适的AMPure磁珠用量。
末端修复后的 DNA 回收率低	清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 。当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

19. 测序过程中可能出现的问题

以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	纳米孔阵列中引入了气泡。	在对通过质检的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。如何为 PromethION 测序芯片上样视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	测序芯片未正确插入测序仪停止运行测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。您也可尝试将芯片插入仪器的其它芯片槽进行测序（如适用）。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	纳米孔阵列中引入了气泡 __	文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞。在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

MinKNOW脚本失败

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）		重启计算机及MinKNOW。重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW日志文件并联系我们的技术支持。如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象	可能原因	措施及备注
纳米孔利用率<40%	测序芯片中的文库量不够。	请确保您按照相应实验指南，向测序芯片中加入正确浓度和体积的测序文库。使用了连接测序试剂盒；但在接头连接后的纯化步骤中并未使用洗涤缓冲液（LFB 或SFB）洗涤，而是使用了酒精。酒精可导致测序接头上的马达蛋白变性。请确保在测序接头连接后使用洗涤缓冲液（LFB或SFB）。
纳米孔利用率接近0	测序芯片中无系绳。测序系绳（FCT）是随着预处理液加至芯片的。请确保在制备预处理液时，将测序芯片系绳（FCT）加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

读长短于预期

现象	可能原因	措施及备注
读长短于预期	DNA样本降解	读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。 1.请查阅纳米孔社区中的提取方法以获得最佳DNA提取方案. 2.在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。! 在上图中，样本 1 为高分子量 DNA，而样本 2 为降解样本。 3. 3.在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象	可能原因	措施及备注
__大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。样本中含有污染物。一使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔"（sequencing pore）。若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加：用户可使用测序芯片冲洗试剂盒 (EXP-WSH004)进行核酸酶冲洗操作。

大量纳米孔处于“失活”（Inactive）状态

现象	可能原因	措施及备注
__大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤）测序芯片中引入了气泡。在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看如何为 PromethION 测序芯片上样了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态	存在与DNA共纯化的化合物	已知的化合物包括多糖等。
大量纳米孔处于失活/不可用状态	样本中含有污染物。您可在“污染物”专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象	可能原因	措施及备注
温度波动	测序芯片和仪器接触不良检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度”.测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热）。 MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）的降低。请调整测序仪的摆放位置，确保将其置于室温下、通风良好的环境中，再在MinKNOW中重启进程。

Oxford Nanopore Technologies, the Wheel icon, AmPORE-TB, EPI2ME, GridION, MinION, MinKNOW, PromethION, P2 Solo, and P2 are registered trademarks or the subject of trademark applications of Oxford Nanopore Technologies plc in various countries. Information contained herein may be protected by copyright, patents or patents pending of Oxford Nanopore Technologies plc. All other brands and names contained are the property of their respective owners. Oxford Nanopore Technologies products are RUO. Products labelled/branded as Oxford Nanopore Diagnostics may be RUO or may be regulated as in‐vitro diagnostic devices in some jurisdictions, please check individual product labelling. ONT plc is a member of the producer compliance scheme run by ERP UK Ltd, who manage the submission of documentation in support of WEEE compliance for ONT plc’s manufacture and supply of Electrical and Electronic equipment in the UK. ONT’s WEEE PRN is WEE/MM3828AA.

设备:

语言:

技术

Pharmacogenomic (PGx) sequencing workflow with adaptive sampling (blood, cells, saliva) (PGXA_9225_v114_revE_17Aug2026)

PromethION: Protocol

Pharmacogenomic (PGx) sequencing workflow with adaptive sampling (blood, cells, saliva) V PGXA_9225_v114_revE_17Aug2026

Contents

实验方案简介

Sample preparation for saliva

Sample preparation for whole blood and cultured cells

文库制备

测序及数据分析

疑难解答

概览

1. 实验方案概览

本品为早期试用设备。

测序工作流程：

样本制备、建库及测序

文库制备

实验方案适用性

2. 仪器及耗材

材料

耗材

仪器

可选仪器

3. Extraction of DNA from a range of biological sample types

4. DNA extraction from saliva

材料

耗材

仪器

可选仪器

Vortex the GeneFix™ collection tubes containing the saliva samples for ten seconds to mix well.

Add 40 µl Proteinase K solution to each tube containing the saliva sample and vortex to mix thoroughly.

60℃ 下孵育 30 分钟。

Transfer the sample solutions into clean 15 ml conical centrifuge tubes.

Add 4 ml of Solution SPN to each 15 ml tube containing the sample, and vortex to mix thoroughly.

3,000 x g 离心 10 分钟。

Carefully pour off the supernatants, taking care not to disturb the pellets.

3,000 x g 离心一分钟。

使用常规移液枪枪头，小心吸去残留的上清液，注意不要扰动 DNA 沉淀。

Add 400 µl Solution TE (Isohelix, GSPN) to each sample tube, and vortex to fully resuspend the samples and mix thoroughly.

Incubate the resuspended samples at room temperature for at least 5 minutes, allowing the DNA to re-hydrate.

Transfer the full volume of each resuspended sample to a clean 2 ml Eppendorf tube.

Centrifuge the sample tubes at 12,000 x g for 15 minutes to remove any undissolved particulates.

Remove the supernatants and transfer to clean 2 ml Eppendorf tubes, being careful not to disturb the pellets.

Add 400 µl of Solution SLS to each tube containing the sample supernatant. Vortex to mix thoroughly.

Add 800 µl Solution SPN to each sample supernatant. Vortex to mix thoroughly.

12,000 x g 离心 10 分钟。

Carefully pour off the supernatants, taking care not to disturb the pellets.

12,000 x g 离心一分钟。

使用常规移液枪枪头，小心吸去残留的上清液，注意不要扰动 DNA 沉淀。

Add 103 µl of Solution TE (Isohelix, GSPN) to each tube containing your pelleted sample, and mix by gently flicking the tube.

37℃ 下孵育 30 分钟。 Gently agitate the solutions by flicking every 5 minutes to aid with resuspension.

3\.使用宽口枪头充分吹打混匀。

Quantify each DNA sample in triplicate using the Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit.

Expected gDNA yield from saliva

Take forward 5 µg gDNA extracted from saliva into the DNA fragmentation step.

5. Fragmentation of saliva extracted DNA

材料

耗材

仪器

可选仪器

Transfer 5 µg of extracted gDNA from each sample into 1.5 ml Eppendorf tubes.

Adjust each volume to 100 μl with TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8).

用移液枪轻轻吹打十次以充分混匀。4.使用迷你离心机瞬时离心。

Load 100 µl of each sample into the top of each g-TUBE. Screw the caps firmly and centrifuge at 6,000 rpm (3,380 RCF) for 1 minute.

After centrifugation, spin the tubes again at 6,000 rpm (3,380 RCF) for 10 seconds to ensure complete passage of all gDNA through the constriction.

Invert each g-TUBE and spin again at the same speed and duration as in step 4: 1\.以 6,000 rpm（3,380 RCF） 离心 1 秒。

Repeat the centrifugation at 6,000 rpm (3,380 RCF) for 10 seconds to ensure thorough passage of all gDNA through the constriction.

Unscrew the tube bodies, leaving the screw-caps containing the samples. 从旋盖中吸出样品，转移至洁净的 1.5 ml Eppendorf 离心管中。

Quantify 1 µl of each fragmented gDNA sample using the Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit.

Expected gDNA yield following fragmentation

Take forward 5 µg of fragmented gDNA in 100 µl, from each sample, into the bead-based size selection step. If the volume is less than 100 µl, make up to 100 µl with TE buffer.

6. Size selection of sheared DNA from saliva

材料

耗材

仪器

可选仪器

Prepare the beads for size selection:

To each 5 µg of sheared saliva sample in 100 µl in a 1.5 ml Eppendorf tube (4 samples), add 310 µl (3.1x) of the diluted (35%) AMPure XP (AXP) beads.

用移液枪轻轻吹打十次以充分混匀。

室温下孵育10分钟。

Invert each g-TUBE and spin again at the same speed and duration as in step 4: 1\.以 6,000 rpm（3,380 RCF）离心 1 秒。

可选：孵育步骤亦可在室温下过夜完成。