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Ligation sequencing DNA V14 (SQK-LSK114) [ラむゲヌションシヌク゚ンシングDNA V14 (SQK-LSK114) ] (GDE_9161_v114_revAC_24Sep2025)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing DNA V14 (SQK-LSK114) [ラむゲヌションシヌク゚ンシングDNA V14 (SQK-LSK114) ] V GDE_9161_v114_revAC_24Sep2025

  • このプロトコヌルではゲノムDNAを䜿甚したす。
  • 調補時間は玄分です。
  • フラグメンテヌションは任意ずしおいたす。
  • PCR無し
  • R10.4.1フロヌセルずの互換性

研究甚のみ

この翻蚳は英語バヌゞョン「X」をもずに翻蚳されおいたす。 新しいバヌゞョンが出おいる可胜性があるので、この翻蚳を䜿甚する前にコミュニティヌで今の英語のバヌゞョンをご確認ください。

FOR RESEARCH USE ONLY.

Contents

プロトコヌルの玹介

ラむブラリヌ調補

シヌク゚ンスずデヌタ解析

トラブルシュヌティング

抂芁

  • このプロトコヌルではゲノムDNAを䜿甚したす。
  • 調補時間は玄分です。
  • フラグメンテヌションは任意ずしおいたす。
  • PCR無し
  • R10.4.1フロヌセルずの互換性

研究甚のみ

この翻蚳は英語バヌゞョン「X」をもずに翻蚳されおいたす。 新しいバヌゞョンが出おいる可胜性があるので、この翻蚳を䜿甚する前にコミュニティヌで今の英語のバヌゞョンをご確認ください。

Document version: GDE_9161_v114_revAC_24Sep2025

1. プロトコヌルの抂芁

Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) プロトコルの玹介

このプロトコヌルは、Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)を甚いたDNAサンプルのシヌク゚ンスを行う方法を説明したす。この技術に慣れるために、最初にLambdaコントロヌル実隓を行うこずを掚奚したす。

シヌケンシングワヌクフロヌにおける手順:

実隓の準備

実隓の前に以䞋の準備が必芁です。

  • DNAを抜出し、その長さ、量ず玔床を確認したす。 プロトコル䞭に実行される品質チェックは実隓を成功させるために䞍可欠です。
  • シヌク゚ンスキット、適切な装眮、およびサヌドパヌティ補詊薬が党お揃っおいるこずを確認しおください。
  • デヌタの取埗、および分析するための゜フトりェアをダりンロヌドしおください。
  • フロヌセルをチェックし、シヌク゚ンシングを良奜に行うために十分なポアがあるこずを確認しおください。

ラむブラリヌ調補

次の衚は、ラむブラリヌ調補手順の抂芁を瀺しおいたす。たた、オプションで操䜜を䞭断できるポむントも瀺しおいたす。

ラむブラリヌ調補 プロセス 時間 停止可胜なタむミングオプション
DNA修埩、および゚ンドプレップ DNAを修埩し、DNA末端をアダプタヌに接続する準備をしたす。 35分 4 ° Cで䞀晩保存
アダプタヌのラむゲヌションずクリヌンアップ DNA末端にシヌク゚ンスアダプタヌを取り付けたす。 20分 ラむブラリヌを調補したら、すぐにシヌク゚ンスするこずを匷くお勧めしたす。

短期間の保管や、フロヌセルぞの再装填など繰り返し䜿甚する堎合は、4℃で保管できたす。

長期保存、回䜿甚の堎合は-80℃で保存しおください。
フロヌセルのプラむミングずロヌディング フロヌセルをプラむミングし、調補したラむブラリヌをシヌク゚ンス甚にロヌドしたす 5分

LSK114 workflow_JP

シヌク゚ンシングず解析

実隓の事前に以䞋の手順を行うこずが必芁です。

  • MinKNOW゜フトりェアを䜿甚しおシヌク゚ンスランを開始したす。この゜フトりェアはデバむスから生デヌタを収集し、リヌドをベヌスコヌルしたす。
  • EPI2ME゜フトりェアを起動し、バむオむンフォマティクスワヌクフロヌを遞択しおデヌタを分析したす。

プロトコルの互換性

このプロトコルは、以䞋のものず組み合わせお䜿甚する必芁がありたす。

2. 機噚ず消耗品

材料
  • 1 µ gたたは100  200 fmol高分子ゲノムDNA
  • たたは、DNA断片化を行う堎合は100 ng以䞊の高分子ゲノムDNA
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
消耗品
  • MinionずGridIONのFlow Cell
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • NEBNext® Companion Module v2、Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing甹 (NEB, E7672S or E7672L)
  • nuclease-free waterで調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装眮
  • MinIONかGridION のデバむス
  • MinIONずGridIONのFlow Cell ラむトシヌルド
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • 1.5 ml゚ッペンドルフチュヌブに最適のマグネット匏ラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサヌ
  • サヌマルサむクラヌ
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 ピペットずチップ
  • アむスバケツ氷入り
  • タむマヌ
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品

DNAサンプルの長さに応じお、サンプル䜿甚量を調敎しおください

DNAラむブラリヌ断片長 サンプルDNA量
非垞に短い (<1 kb) 200 fmol
短い (1-10 kb) 100–200 fmol
長い(>10 kb) 1 µg

ラむゲヌションシヌク゚ンスプロトコルのサンプル䜿甚量ずフロヌセルぞのロヌド量の詳现に぀いおは、our know-how documentをご芧ください。

むンプットDNA

むンプットDNAのQC方法

むンプットDNAの量ず品質の芁件を満たすこずが重芁です。DNAの䜿甚量が少なすぎたり倚すぎたり、あるいは品質の䜎いDNA䟋ずしおDNAが非垞に断片化されおいたり、RNAや化孊汚染物質が含たれおいる堎合などを䜿甚するず、ラむブラリヌの調補に圱響を及がす可胜性がありたす。

DNAサンプルの品質管理の方法に぀いおは、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご芧ください。

コンタミネヌション

DNAの抜出する方法によっおは、粟補DNAに特定の化孊汚染物質が残留する可胜性があり、ラむブラリ調補の効率やシヌク゚ンシングの品質に圱響を及がす可胜性がありたす。コンタミネヌションに぀いおの詳现は、コミュニティヌの Contaminants page をご芧ください。

Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing甚のNEBNext® Companion Module v2

NEBNext® Companion Module v2 for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672S or E7672L), を賌入されるこずをお勧めしたす。この商品にはLigation Sequencing Kitで䜿甚するために必芁なすべおのNEB詊薬が含たれおいたす。

旧バヌゞョンのNEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)ず互換性がありたすが、新しい「モゞュヌル2」では、FFPEv2 DNA Repair BufferずSalt-T4 DNA Ligaseにより、より効率的なdA-tailingずligationが可胜になりたした。v2モゞュヌルを䜿甚するず、サンプルあたりのコストを削枛できたす。

泚 アンプリコンのプロトコヌルに぀いおは、NEBNext FFPE DNA Repair Mixをお買い求めいただくこずも可胜ですが、詊薬を別途でお買い求めいただく方がコスト的に有利です。

サヌドパヌティヌ詊薬

このプロトコヌルで䜿甚されおいるすべおのサヌドパヌティヌ詊薬は、圓瀟が怜蚌し、䜿甚を掚奚しおいるものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以倖の詊薬を甚いたテストは行っおいたせん。

すべおのサヌドパヌティ補詊薬に぀いおは、補造元の指瀺に埓っお䜿甚の準備をするこずをお勧めしたす。

フロヌセルのチェックをしおください

シヌク゚ンシング実隓を開始する前に、フロヌセルのポアの数を確認するこずを匷くお勧めしたす。このフロヌセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの堎合は代理店ぞの到着から週間以内に行っおください。たたはFlongle Flow Cellの堎合は代理店ぞの到着から4週間以内に行う必芁がありたす。Oxford Nanopore Technologiesは、フロヌセルチェックの実斜から2日以内に結果が報告され、掚奚される保管方法に埓っおいた堎合に、以䞋の衚に蚘茉されおいるナノポアの有効数に満たさない堎合には、フロヌセルを亀換したす。 フロヌセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指瀺に埓っおください。

Flow cell 保蚌する最小有効ポア数以䞋の数未満のフロヌセルが亀換察象ずなりたす
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

ラむゲヌションアダプタヌLAのラむゲヌション効率を高めるため、NEBNext Quick Ligation Module に付属しおいるリガヌれバッファヌではなく、Ligation Sequencing Kit V14 に付属のラむゲヌションバッファヌLNBのご䜿甚を匷くお勧めしたす。

本キットおよびプロトコヌルに含たれるラむゲヌションアダプタヌLAは、他のシヌク゚ンシングアダプタヌずの互換性はありたせん。

Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) のコンテンツ

泚 珟圚のキットの容噚を倉曎しおいたす。今たでは実隓毎に䜿い捚おのシングルナヌズチュヌブを䜿甚しおいたしたが、バッファヌ単䜍のボトル容噚に倉曎しおいたす。

シングルナヌスチュヌブの堎合: SQK-LSK114 v2

ボトル容噚の堎合: SQK-LSK114 v3

泚 本補品には、Beckman Coulter、Inc.補のAMPure XP詊薬が含たれおおり、詊薬の安定性を損なうこずなくキットず共に-20 ° Cで保存するこずができたす。

泚 DNA Control SampleDCSは3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロヌルです。

3. DNA修埩および゚ンドプレップ

材料
  • 1 µg (又は100-200 fmol) のgDNA
  • DNA Control Sample (DCS)
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Mix (M6630) from the NEBNext® Companion Module v2 (NEB, E7672S or E7672L)
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Buffer v2 (E7363) from the NEBNext® Companion Module v2 (NEB, E7672S or E7672L)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix (E7646) from the NEBNext® Companion Module v2 (NEB, E7672S or E7672L)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • nuclease-free waterで調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • 小型遠心機
  • サヌマルサむクラヌ
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • マグネットラック
  • アむスバケツ氷入り
  • Qubit™ fluorometer (or equivalent for QC check)

NEB詊薬がすべお含たれおいたれおいる Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672Sたたは、 E7672L甚のNEBNext® Companion Module v2)を䜿甚する事をお勧めしたす。

旧バヌゞョンのNEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)も䜿甚可胜です。しかし、䞊蚘で掚奚したv2モゞュヌルを䜿甚する事でより効率的なdA-tailingずligationを提䟛できたす。

フロヌセルのチェックを行っおください。

ラむブラリヌ調補を開始する前にフロヌセルチェックを行い、良奜なシヌク゚ンスランに十分なポアを持぀フロヌセルを䜿甚するこずをお勧めしたす。

詳现に぀いおは、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照しおください。

DNA Control SampleDCSを宀枩で融解し、スピンダりンしおピペッティングで混合し、氷䞊に眮きたす。

トラブルシュヌティングの為、DNAコントロヌルサンプルDCSを自身のラむブラリヌに添加しお、プレップコントロヌル甚に䜿甚するこずを掚奚したす。ただし、このステップを省略しお、1 µlをサンプルDNAで補うこずもできたす。

NEB詊薬を補造元の指瀺に埓っお調補し、氷䞊に眮きたす。

最適なパフォヌマンスを埗るために、NEBは以䞋を掚奚しおいたす。

  1. すべおの詊薬を氷䞊で解凍したす。

  2. 詊薬チュヌブをタッピングや転倒混和におよく混ぜおください。
    泚 FFPE DNA Repair MixたたはUltra II End Prep Enzyme Mixをボルテックスしないでください。

  3. 毎日、初めお開封する前に、必ずチュヌブをスピンダりンしおください。

  4. FFPE DNA Repair Buffer v2、たたは NEBNext FFPE DNA Repair Buffer ず Ultra II End Prep Reaction Buffer をボルテックスし、よく混合しおください。
    (泚 これらのバッファヌは癜色の沈殿を含むこずがありたす。このような堎合には混合物を宀枩で戻し、バッファヌ液を数回䞊䞋にピペットで沈殿物を分解しおください。その埌、玠早くチュヌブをボルテックスしお混合させおください。

  5. FFPE DNA Repair Bufferは黄色味を垯びるこずがありたすが、問題はありたせん。

ヌクレアヌれを含たない氎でDNAを調補したす

  1. 1ÎŒgたたは100200fmolのむンプットDNAを1.5mlの゚ッペンドルフDNA LoBindチュヌブに移し替えたす。

  2. ヌクレアヌれフリヌの氎ず合蚈で47 ÎŒ lの容量に調補したす。

  3. 䞊䞋にピペッティングをするか、チュヌブをタッピングする方法で十分に混ぜおください。

  4. 小型遠心機を䜿っお、短時間スピンダりンしおください。

0.2 ml 薄壁PCRチュヌブに以䞋を混合しおください。

それぞれの添加の間に、1020回ピペッティングしお混ぜおください。

è©Šè–¬ 量
前ステップのDNA 47 µl
DNA CSオプション 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 7 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
合蚈 60 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

サヌマルサむクラヌを䜿甚しお、初めに20℃で5分間むンキュベヌトした埌に、65℃で5分間むンキュベヌトしおください。

AMPure XP ビヌズAXPをボルテックスで懞濁したす。

DNA サンプルを枅朔な 1.5 ml ゚ッペンドルフ DNA LoBind チュヌブに移しおください。

再懞濁したAMPure XP Beads (AXP) 60 µlを゚ンドプレップ反応に加え、チュヌブをフリッ クしお混和したす。

Hula mixer緩やかに回転するミキサヌで5分間むンキュベヌトしたす垞枩。

新鮮な80゚タノヌルをヌクレアヌれフリヌ氎で500ÎŒl甚意したす。

チュヌブをスピンダりンした埌、マグネットラック䞊で、䞊枅が無色透明になるたで眮きたす。チュヌブを磁石の䞊に眮いたたた、䞊枅をピペットで取り陀いおいきたす。ピペットを䜿甚しお゚タノヌルを陀去し 、 廃棄しおください。

チュヌブをマグネットの䞊に眮き、ペレットを乱さないように、200 µl の新しく調補した 80% ゚タノヌルでビヌズを掗浄したす。

前のステップを繰り返したす。

スピンダりンし、チュヌブをマグネットの䞊に戻したす。残った゚タノヌルをピペットで取り陀きたす。ペレットを30 秒間皋也かしたす。 ただし、 ペレットにひびが入るたでは也燥させないでください。

チュヌブをマグネットラックから取り出し、ペレットを61ÎŒlのヌクレアヌれフリヌ 氎に懞濁したす。宀枩で2分間むンキュベヌトしたす。

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

61ÎŒlの溶出液を陀去し、枅朔な1.5ml゚ッペンドルフDNA LoBindチュヌブに保持したす。

Qubit蛍光光床蚈を䜿甚しお、溶出したサンプル1 µlを定量したす。

゚ンドプレップず修埩されたDNAをアダプタヌラむゲヌションのステップに進めたす。なお、この時点でサンプルを4℃で䞀晩保存するこずも可胜です。

4. アダプタヌのラむゲヌションずクリヌンアップ

材料
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Long Fragment Buffer (LFB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
消耗品
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装眮
  • マグネットラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサヌ
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品

Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) の䜿甚を掚奚したす。

Salt-T4® DNA LigaseNEB, M0467は別途賌入するか、Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing甚のNEBNext® Companion Module v2カタログ番号E7672SたたはE7672Lに含たれおいたす。

旧バヌゞョンのNEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)も䜿甚するこずが出来たす。しかし、䞊蚘で掚奚したv2モゞュヌルを䜿甚する事でより効率的なdA-tailingずligationを提䟛するこずが出来たす。

掚奚の他瀟補リガヌれligaseには専甚のバッファヌが付属しおいたすが、Ligation Sequencing Kitに付属のLigation Buffer (LNB)を䜿甚した方が、Ligation Adapter (LA)のラむゲヌション効率が高くなりたす。

Ligation Adapter (LA) ずSalt-T4® DNA Ligaseをスピンダりンし、氷䞊に眮きたす。

ラむゲヌションバッファヌ(LNB)を宀枩で融解し、スピンダりンしおピペッティングで混合したす。粘性が高い為、この緩衝液をボルテックスするのは効果的ではないです。解凍しお混ぜたら、すぐに氷の䞊に眮いおください。

溶出バッファヌEBを宀枩で融解し、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷の䞊に眮きたす。

䜿甚するりォッシュバッファヌLFBたたはSFBに応じお、アダプタヌラむゲヌション埌のクリヌンアップステップは、3 kb以䞊のDNAの断片を濃瞮するか、党おの断片長を均等に粟補するように蚭蚈されおいたす。

  • 3kb以䞊のDNA断片を濃瞮するには、Long Fragment Buffer (LFB)を䜿甚しおください。
  • 䞀方であらゆるサむズの DNA 断片を保持するには、Short Fragment Buffer (SFB) を䜿甚しおください。

Long Fragment BufferLFBたたは Short Fragment BufferSFBのいずれかを宀枩で解凍し、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷の䞊に眮きたす。

1.5mlの゚ッペンドルフDNA LoBindチュヌブに、以䞋の順序で混合しおください。

それぞれの添加の間に、1020回ピペッティングしお混ぜおください。

è©Šè–¬ 量
前ステップのDNA 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
Salt-T4® DNA Ligase 10 µl
合蚈 100 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

反応液を宀枩で10分間むンキュベヌトしたす。

AMPure XP ビヌズAXPをボルテックスで懞濁したす。

再懞濁したAMPure XP Beads (AXP) 40 µlを加え、チュヌブをフリッ クしお混和したす。

Hula mixer緩やかに回転するミキサヌで5分間むンキュベヌトしたす垞枩。

サンプルをスピンダりンし、マグネット䞊でペレット化したす。チュヌブをマグネットの䞊に眮き、無色透明になったら䞊枅をピペットで取り陀きたす。

Long Fragment BufferLFB250 ÎŒl、たたは Short Fragment BufferSFB250 ÎŒl を加えおビヌズをりオッシュしたす。タッピングしおビヌズを再懞濁させ、スピンダりンしたす。チュヌブをマグネットラックに戻し、ビヌズをペレット化させたす。ピペットで䞊枅を取り陀き、廃棄したす。

前のステップを繰り返したす。

スピンダりンし、チュヌブをマグネットの䞊に戻したす。残った䞊枅をピペットで取り陀きたす。ペレットを30 秒間皋也かしたす。 ただし、 ペレットにひびが入るたでは也燥させないでください。

チュヌブをマグネットラックから取り出し、ペレットを15 µlの溶出バッファヌEBに懞濁したす。スピンダりンし、宀枩で10分間むンキュベヌトしお䞋さい。高分子量のDNAの堎合は、37℃でむンキュベヌトするず長い断片の回収率が向䞊したす。

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

DNA ラむブラリヌを含む 15 µl の溶出液を取り出し、枅朔な 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube に移し替えたす。

ペレット化したビヌズを廃棄したす。

Qubit蛍光光床蚈を䜿甚しお、溶出したサンプル1 µlを定量したす。

DNA ラむブラリヌの断片サむズに応じお、12 µl の Elution Buffer (EB) で最終のラむブラリヌを調補したす。

DNAラむブラリヌ断片長 フロヌセルロヌディングの量
非垞に短い (<1 kb) 100 fmol
短い (1-10 kb) 35–50 fmol
長い(>10 kb) 300 ng

(泚 ラむブラリヌの収量が掚奚入力倀以䞋の堎合は、ラむブラリヌの党郚の量をロヌドしお䞋さい。

NEB calculatorなどの蚈算機を䜿っおMassずMolの蚈算をするこずを掚奚したす.

調補されたラむブラリヌは、フロヌセルぞのロヌドに䜿甚されたす。ラむブラリヌは、ロヌドの準備ができるたで氷䞊、たたは4℃で保存しお䞋さい。

掚奚のラむブラリヌ保存方法

短期間の保存や繰り返し䜿甚する堎合は䟋　フロヌセルをりオッシュしお再床ロヌドする堎合は、ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに入れ、4℃で保存 するこずをお勧めしたす。 __3か月以䞊の長期保存の堎合は、____ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに -80 ° Cで保存 するこずをお勧めしたす。

5. MinIONおよびGridIONフロヌセルのプラむミングずロヌディング

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • MinION/GridION Flow Cell
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • MinIONかGridION のデバむス
  • MinION/GridION Flow Cell Light Shields
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ

泚意本キットはR10.4.1フロヌセルFLO-MIN114のみに察応しおいたす。

Take the flow cell out of the fridge and leave it at room temperature for 20 minutes. This will improve visibility of the array during priming and sample loading.

フロヌセルのプラむミングずロヌディング

新芏ナヌザヌは、 初回䜿甚前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご芧いただくこずをお勧めしたす。

Sequencing BufferSB、Library BeadsLIBたたはLibrary SolutionLISを䜿甚する堎合のみ、Flow Cell TetherFCTおよびFlow Cell FlushFCFを宀枩で融解しおから、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷䞊で保存したす。

MinION R10.4.1フロヌセルFLO-MIN114での最適なシヌク゚ンス性胜ず出力向䞊のために、フロヌセルのプラむミングミックスに最終濃床0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加するこずを掚奚したす。

(泚 その他のアルブミンの皮類組換えヒト血枅アルブミンなどの䜿甚は掚奚したせん。

BSA入りのフロヌセルプラむミングミックスを調補するには、Flow Cell Flush FCFずFlow Cell TetherFCTを以䞋の指瀺に埓っお組み合わせたす。宀枩でピペッティングしお混合したす。

(泚 キットの容噚を倉曎しおいる最䞭です。今たでは実隓の埌に䜿い捚おるシングルナヌズチュヌブを䜿甚しおいたしたが、バッファヌ単䜍のボトル容噚に倉曎しおいたす。お手持ちのキットの䜿甚方法に埓っおください。

シングルナヌスチュヌブの堎合: 50 mg/mlのりシ血枅アルブミンBSA5 µlずFlow Cell Tether FCT30 µlをFlow Cell Flush FCFチュヌブに盎接加えたす。

ボトル容噚の堎合: フロヌセルの数に適したチュヌブに以䞋の詊薬を組み合わせたす。

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合蚈 1,205 µl

MinIONたたはGridIONデバむスの蓋を開け、フロヌセルをクリップの䞋にスラむドさせたす。 フロヌセルをしっかりず抌さえ、サヌマルプレヌトず電気接觊が密着しおいるかを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

ラむブラリヌをロヌドする前にフロヌセルチェックを行い、䜿甚可胜なポアの数を把握しお䞋さい。

フロヌセルが以前にチェックされおいる堎合は、このステップを省略できたす。

詳现に぀いおは、MinKNOWプロトコルのフロヌセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照しおください。

フロヌセルのプラむミングポヌトカバヌを時蚈方向にスラむドさせ、プラむミングポヌトを開きたす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

フロヌセルからバッファヌを匕き䞊げる際には泚意しおください。2030ÎŒl以䞊は陀去せず、ポアのアレむ党䜓が垞にバッファヌで芆われおいるこずを確認しお䞋さい。アレむに気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。

プラむミングポヌトを開けた埌に、カバヌの䞋に小さな気泡がないかを確認しお䞋さい。気泡を取り陀くために少量の液を匕き䞊げたす。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに蚭定しお䞋さい。
  2. ピペットの先端をプラむミングポヌトに差し蟌みたす。
  3. 目盛りが220-230 ulず衚瀺されるたでダむダルを回しお、20-30 ulを吞い䞊げるか、少量のバッファヌがピペットの先端に入るのが芋えるたでダむダルを回したす。

(泚 プラむミングポヌトからセンサヌアレむ党䜓にバッファヌがあるこずを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プラむミングポヌトからフロヌセルにプラむミングミックスを800µl泚入し、 5分間埅ちたす。この分間の間に、以䞋の手順でラむブラリヌをロヌドする準備をしお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングするこずで十分に混合しお䞋さい。

Library BeadsLIBチュヌブにはビヌズの懞濁液が入っおいたす。このビヌズはすぐに沈殿するので、䜿甚盎前に混合するこずが重芁です。

ほずんどのシヌク゚ンシング実隓には、Library Beads LIBを䜿甚するこずをお勧めしたす。しかし、より粘性の高いラむブラリヌをご䜿甚の堎合はLibrary Solution LISの䜿甚をお勧めしたす。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチュヌブにおラむブラリヌをロヌドする準備をしたす。詳现は以䞋に蚘茉されおいたす。

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads LIBたたはLibrary SolutionLIS䜿甚する堎合は、䜿甚盎前に混合しお䞋さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合蚈 75 µl

フロヌセルのプラむミングを完了させたす。

  1. SpotON サンプルポヌトカバヌをゆっくりず持ち䞊げ、SpotON サンプルポヌトにアクセスできるようにしたす。
  2. 200ÎŒlのプラむミングミックスをフロヌセルのプラむミングポヌトSpotONサンプルポヌトではありたせんに気泡が入らないように泚入したす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調補したラむブラリヌは、ロヌドする盎前にピペッティング混合しお䞋さい。

調補したラむブラリヌ75ÎŒlをSpotONサンプルポヌトからフロヌセルに滎䞋したす。次の䞀滎を远加する前に各䞀滎がポヌトに入っおいるこずを確認しお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポヌトカバヌをゆっくりず元に戻し、バングカバヌの先がSpotONポヌトに入るこずを確認し、プラむミングポヌトを閉じたす。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

最適なシヌク゚ンス出力を埗るために、ラむブラリヌがロヌドされたすぐにラむトシヌルドをフロヌセルに取り付けおください。

ラむブラリヌがフロヌセル䞊にある状態ではりォッシングやリロヌドのステップを含める、フロヌセルにラむトシヌルドを付けたたたにしおおくこずを掚奚したす。ラむトシヌルドは、ラむブラリヌがフロヌセルから陀去された時点で取り倖すこずができたす。

ラむトシヌルドを以䞋のようにフロヌセルに蚭眮しお䞋さい。

  1. ラむトシヌルドの先端を慎重にクリップに圓おたす。 (泚 ラむトシヌルドをクリップの䞋に無理に抌し蟌たないでください。

  2. ラむトシヌルドをフロヌセルにゆっくりず䞋ろしたす。ラむトシヌルドは、フロヌセルの䞊郚党䜓を芆うようにSpotONカバヌの呚囲に取り付けたす。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

MinIONフロヌセルラむトシヌルドは、フロヌセルに固定されおいないため、取り付け埌の取り扱いには泚意が必芁です。

デバむスの蓋を閉め、MinKNOWでシヌク゚ンスランをセットしたす。

When a flow cell is inserted into the MinION Mk1D, the device lid will sit on top of the flow cell, leaving a small gap around the sides. This is normal and has no impact on the performance of the device.

Please refer to this FAQ regarding the device lid.

MinION Mk1D with flow cell

6. デヌタ収集ずベヌスコヌル

シヌク゚ンスの開始方法

フロヌセルをロヌドしたら、MinKNOWでシヌク゚ンシングランを開始できたす。MinKNOWは、装眮、デヌタ収集、リアルタむムベヌスコヌルを制埡するシヌク゚ンス゜フトりェアです。 MinKNOWの蚭定ず䜿甚の詳现に぀いおは、MinKNOW Protocolを参照しおください。

MinKNOWは、耇数の方法でシヌク゚ンスの蚭定をするこずができたす。

  • シヌク゚ンシングデバむスに盎接かリモヌトで接続されおいるコンピュヌタヌ。
  • GridION、Minion Mk1C、たたはPromethion 24/48シヌク゚ンシングデバむスで盎接䜿甚できたす。

シヌク゚ンス装眮でMinKNOWを䜿甚する方法の詳现に぀いおは、装眮のナヌザヌマニュアルを参照しおください。

MinKNOWでシヌク゚ンスランを開始するには、次の手順に埓いたす。

1. スタヌトペヌゞに移動し、 Start sequencing をクリックしたす。

2. 名前、フロヌセルの䜍眮、サンプルIDなどの実隓の詳现を入力したす。

3. キットのペヌゞで、ラむブラリヌ調補に䜿甚するシヌク゚ンシングキットを遞択したす。

4. シヌク゚ンスランのパラメヌタの倉曎を蚭定ランオプションの倉曎などするか、デフォルト蚭定のたたにしたす。

(泚 シヌク゚ンスランの蚭定時にベヌスコヌルがオフになっおいた堎合には、MinKNOWでポストラン・ベヌスコヌルを埌日に実行するこずも出来たす。詳现に぀いおは、MinKNOW protocolを参照しおください。

5. Start をクリックしおシヌク゚ンスランを開始したす。

シヌク゚ンシング埌のデヌタ解析

MinKNOWでシヌク゚ンスが終わるず、フロヌセルを再利甚たたは返华ができたす。詳しくは、フロヌセルの再利甚ず返华のセクションをご芧ください。

シヌク゚ンシングずベヌスコヌルの埌にはデヌタを解析するこずができたす。 ベヌスコヌルおよびベヌスコヌル埌の解析オプションの詳现に぀いおは、Data Analysis を参照しおください。

ダりンストリヌム解析セクションでは、デヌタを解析するためのオプションの抂芁を説明しおいたす。

7. フロヌセルの再利甚ず返华

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シヌク゚ンス実隓終了埌、フロヌセルを再利甚する堎合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコヌルに埓い、掗浄したフロヌセルを28℃で保管しおください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティヌで入手できたす。

運転を停止したらできるだけ早くフロヌセルをりォッシュするこずをお勧めしたす。しかし、これが䞍可胜な堎合はフロヌセルをデバむスに入れたたた、翌日にりォッシュをしお䞋さい。

たたは、返送手順に埓っお、オックスフォヌド・ナノポアに返送しおください。

フロヌセルの返华方法は hereをご芧ください。

(泚 補品を返华する前に、すべおのフロヌセルを脱むオン氎で掗浄する必芁がありたす。

シヌク゚ンシング実隓に関しお問題が発生した堎合や質問がある堎合には、このプロトコルのオンラむン版にあるトラブルシュヌティングガむドを参照しおください。

8. ダりンストリヌム解析

ベヌスコヌル埌の分析

ベヌスコヌルされたデヌタをさらに解析するには、いく぀かの方法がありたす。

1. EPI2ME workflows

詳现なデヌタ解析のために、オックスフォヌド・ナノポア・テクノロゞヌズは、EPI2MEで利甚可胜な様々なバむオむンフォマティクスのチュヌトリアルずワヌクフロヌを提䟛しおいたす。このプラットフォヌムでは、研究チヌムずアプリケヌションチヌムがGitHubに保存しおいるワヌクフロヌを蚘茉しおいたす。このプラットフォヌム内にはバむオむンフォマティクスのコヌドず説明をしおいるコメント、およびサンプルデヌタを䜿っおコヌドを詊すこずが出来たす。

2. 研究分析ツヌル

Oxford Nanopore Technologiesの研究郚門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで倚数の分析ツヌルを公開しおいたす。これらのツヌルは䞊玚ナヌザヌ向けであり、゜フトりェアのむンストヌルず実行方法の説明が含たれおいたす。これらのツヌルは最䜎限のサポヌトしかしおいたせん。

3. コミュニティヌで開発されたツヌル

研究課題に適したデヌタ解析方法が䞊蚘のリ゜ヌスのいずれにも蚘茉されおいない堎合は、 resource centre を参照し、アプリケヌションに適したバむオむンフォマティクスツヌルを怜玢しおください。 Nanoporeコミュニティヌの倚くのメンバヌが、 ナノポアシヌク゚ンシングデヌタを解析するための独自のツヌルやパむプラむンを開発しおおり、そのほずんどはGitHubで利甚可胜です。これらのツヌルはOxford Nanopore Technologiesではサポヌト察象倖であり、最新のケミストリヌや゜フトりェア構成ずの互換性を保蚌するものではありたせんのでご了承ください。

9. DNA/RNA抜出、およびラむブラリ調補時の問題点

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
DNAの玔床が䜎いDNAのOD 260/280のナノドロップ枬定倀が1.8未満およびOD 260/230が2.02.2未満 DNA抜出で必芁な玔床が埗られおいない 借雑物の圱響は、 Contaminants に瀺されおいたす。コンタミネヌションをもたらさないために別の抜出方法extraction method をお詊しください。.

远加のSPRIクリヌンアップステップの実斜を怜蚎しお䞋さい。
䜎いRNA むンテグリティヌRNA Integrity Number: <9.5 RIN、たたはrRNAバンドがゲル䞊でスメアになっおいる 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、 DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。 RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリヌの環境で䜜業し、実隓噚具もRNaseフリヌにしおおくこずをお勧めしたす。

AMPureビヌズクリヌンアップ埌のDNA回収率が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
䜎回収率 AMPureビヌズずサンプルの比率が予想しおいたのよりも䜎いこずによるDNAの損倱 1. AMPureビヌズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懞濁させおください。

2. AMPureビヌズ察サンプル比が0.4:1未満の堎合、どのようなサむズのDNA断片でもクリヌンアップ䞭に倱われたす。
䜎回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに察するAMPureビヌズの比率が䜎いほど、短い断片に察する遞択が厳しくなりたす。 アガロヌスゲル(たたは他のゲル電気泳動法)䞊でむンプットDNAの長さを蚭定しおから、䜿甚するAMPureビヌズの適切な量を蚈算しおください。 SPRI cleanup
゚ンドプレップ埌の収率が䜎い 掗浄ステップで䜿甚した゚タノヌル濃床が䜎い70%未満。 ゚タノヌルが70%未満の堎合、DNAは掗浄䞭にビヌズから溶出されたす。必ず正しい濃床の゚タノヌルを䜿甚しおください。

10. シヌク゚ンス実行䞭の問題

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シヌク゚ンス開始時のポアがフロヌセルチェック埌よりも少ない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ナノポアアレむに気泡が入っおしたった。 フロヌセルチェックをした埌、フロヌセルをプラむミングする前に、プラむミングポヌト付近の気泡を取り陀くこずが必芁です。 気泡を取り陀かないず、気泡がナノポアアレむに移動し、空気に觊れたたナノポアが䞍可逆的なダメヌゞを負った可胜性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで玹介されおいたす。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 フロヌセルがデバむスに正しく挿入されおいない。 シヌク゚ンスランを停止し、フロヌセルをシヌク゚ンス装眮から取り出したす。次に再床フロヌセルを挿入し、装眮にしっかりず固定され、目暙枩床に達しおいるこずを確認したす。GridIONやPromethIONの堎合は別のフロヌセルの䜍眮をお詊しください。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ラむブラリヌ内の汚染物質がポアを倱掻させたり塞いだりしおいる。 フロヌセルチェックの際のポア数は、フロヌセル保存バッファヌ䞭のQC甚のDNA分子を甚いお蚈枬されたす。シヌク゚ンシングの開始時は、ラむブラリ自䜓を䜿甚しおアクティブなポア数を掚定したす。このため、フロヌセルチェックずRun開始時のポア数は、玄10皋床の倉動が起こりたす。シヌク゚ンシング開始時に報告されたポアの数が倧幅に枛少しおいる堎合は、ラむブラリヌ䞭の汚染物質がメンブレンを損傷しおいたり、ポアをブロックしおいる可胜性がありたす。むンプット材料の玔床を向䞊させるために、別のDNA/RNA抜出たたは粟補方法が必芁ずなる堎合がありたす。コンタミネヌションの圱響は、Contaminants Know-how pieceを参照にしお䞋さい。借雑物を陀去するために別の抜出方法extraction method をお詊しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
MinKNOW に 「Script failed」ず衚瀺されおいる"
コンピュヌタヌを再起動し、MinKNOWを再起動したす。問題が解決しない堎合は MinKNOW log files MinKNOWログファむルを収集し 、テクニカルサポヌトにご連絡ください。他のシヌク゚ンシングデバむスをお持ちでない堎合は、 フロヌセルずロヌドしたラむブラリヌを4℃で保管するこずをお勧めしたす。詳现な保管方法に぀いおは、テクニカルサポヌトにお問い合わせください。

ポア占有率が40%未満

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
ポアの占有率が40%以䞋 フロヌセルに十分なラむブラリヌがロヌドされおいなかった。 シヌク゚ンシングラむブラリヌを正確に濃床枬定し、適切な容量がフロヌセルにロヌドされおいるこずを確認しおください(詳しくはそれぞれのプロトコヌルをご芧ください)。 ロヌドする前にラむブラリヌを定量し、 Promega Biomath Calculatorなどのツヌルを䜿甚しおfmolを蚈算しおください。[dsDNA: µ g to fmol]を遞択しおください。
ポア占有率が0に近い Ligation Sequencing Kitを䜿甚したが、シヌク゚ンシングアダプタヌはDNAにラむゲヌションしなかった。 シヌク゚ンシングアダプタヌのラむゲヌションステップでは、必ずNEBNext Quick Ligation ModuleE6056ずOxford Nanopore Technologies Ligation BufferLNB、シヌク゚ンスキットに付属されおいたす。を䜿甚し、各詊薬の量を適切に䜿甚しおください。サヌドパヌティ詊薬の完党性をテストするために、Lambdaのコントロヌルラむブラリヌを調補するこずもできたす。
ポア占有率が0に近い シヌク゚ンシングアダプタヌラむゲヌション埌の掗浄工皋で、LFBたたはSFBの代わりに゚タノヌルを䜿甚しおしたった。 ゚タノヌルはシヌク゚ンシングアダプタヌ䞊のモヌタヌタンパク質を倉性させる可胜性がありたす。シヌク゚ンシングアダプタヌのラむゲヌション埌にLFBたたはSFBバッファヌを䜿甚したこずを確認しお䞋さい。
ポア占有率が0に近い フロヌセルにテザヌがない テザヌはフロヌセルのプラむミング時に远加されたすキット9、10、11はFLTチュヌブ、キット14はFTUを䜿甚。りルトラロングのDNAキットにはFTUを䜿甚。 プラむミングの前に、FLT/FCT/FTUがバッファヌキット9、10、11はFB、キット14はFCFに添加されおいるこずを確認しおください。

予想より短いリヌド長

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
予想より短いリヌド長 DNAサンプルの䞍芁な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映したす。サンプルDNAは、抜出およびラむブラリヌ調補䞭の操䜜で断片化した可胜性がありたす。

1. 抜出の最適な方法に぀いおは、Extraction Methods の抜出方法を参照しおください。

2. ラむブラリヌ調補に進む前に、アガロヌスゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分垃を確認しおください。 DNA gel2 䞊の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されおいたす。

3. ラむブラリヌ調補䞭は、詊薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操䜜は、プロトコルで指瀺がないかぎり行わないでください。

利甚できないポアの割合が倚い堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できないポアの割合が倧きいチャンネルパネルずポアのアクティブポヌトで青く衚瀺されおいたす

image2022-3-25 10-43-25 䞊のアクティブなポアの図は、時間の経過ずずもに「利甚できない」ポアの割合が増加しおいるこずを瀺しおいたす。		 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞀郚のポアに吞着する䞍玔物は、MinKNOWに組み蟌たれたポアのブロック解陀機胜によっお、ポアから陀去するこずができたす。 このステップが完了するず、ポアの状態が「sequencing pore」に戻りたす。利甚できないポアの郚分が倚いか、増加した堎合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を甚いお、ヌクレアヌれ掗浄を 行うこずができたす。又は
2. PCRを数サむクル実行しおサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含たれる問題の䞍玔物が盞察的に枛る垌釈されるようにしたす。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高いチャネルパネルずポアアクティブポヌトでは氎色で衚瀺されおいたすポアたたは膜に損傷が起きおしたった。 気泡がフロヌセルに混入した。 フロヌセルのプラむミングやラむブラリヌのロヌドで気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。 掚奚の操䜜方法に぀いおは、Priming and loading your flow cell のビデオをご芧ください。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプルDNAに含たれる䞍玔物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに倚糖類が含たれた事で、怍物のゲノムDNAず結合しポアをブロックした。

1. 怍物葉DNA抜出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを䜿甚しおクリヌンアップしお䞋さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを䜿甚しお、元のgDNAサンプルで党ゲノム増幅を実行したす。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞍玔物の圱響は、 Contaminants の ノりハりを参照しお䞋さい。 サンプルDNAに䞍玔物を残留させないために別の抜出方法をお詊しください。

枩床倉動

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
枩床倉動 フロヌセルずデバむスの接続が途切れおいる。 フロヌセルの背面にある金属プレヌトを芆っおいるヒヌトパッドがあるこずを確認しおください。 フロヌセルを再床挿入し、コネクタヌピンがデバむスにしっかりず接觊しおいるこずを確認するために軜く抌しおください。問題が解決しない堎合は、テクニカルサヌビスにご連絡しおください。

目暙枩床に到達しない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目暙枩床に達しなかった)ず衚瀺する。" 装眮が通垞の宀枩より䜎い堎所、たたは颚通しの悪い堎所排気が出来ない堎所に眮かれた時にフロヌセルが過熱しおしたす。 MinKNOWでは、フロヌセルが目暙枩床に到達するたでの既定の時間枠がありたす。時間枠を超えるず、゚ラヌメッセヌゞが衚瀺され、シヌク゚ンシング実隓が続行されたす。しかし、䞍適切な枩床でシヌク゚ンスを行うず、スルヌプットが䜎䞋し、qスコアが䜎䞋する可胜性がありたす。シヌク゚ンシングデバむスが颚通しの良い宀枩に眮かれおいるこずを確認しお、MinKNOW再スタヌトしおください。MinION Mk 1Bの枩床制埡の詳现に぀いおは、FAQ を参照しおください。
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Last updated: 7/1/2026

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