Este protocolo describe un método completo de preparación y secuenciación de ADNg a partir de muestras de cultivos celulares, así como de análisis en EPI2ME con el flujo de trabajo "Human variation". La identificación de variantes estructurales (VS) y variantes de un solo nucleótido (SNV) desempeña un papel fundamental en nuestra comprensión de la diversidad genética, los mecanismos de la enfermedad y la biología evolutiva. El protocolo tiene como objetivo producir bibliotecas con un N50 de lectura de ~15 kb y alcanzar una cobertura del genoma de ~30-40×, lo que proporciona una identificación fiable de variantes pequeñas y grandes, además de información sobre metilación y la fase de las variantes.

A grandes rasgos, el ADN genómico se extrae de 5 millones de cultivos celulares con el kit Puregene Cell de QIAGEN. A continuación, se selecciona su tamaño con el kit Short Fragment Eliminator (EXP-SFE001) y se fragmenta con Megaruptor® 3† (Diagenode). Las bibliotecas se preparan con el kit Ligation Sequencing V14 (SQK-LSK114).

Se secuencian en PromethION; asimismo, se incluyen instrucciones de lavado y recarga de las celdas de flujo, que se realizan dos veces, lo que aumenta al máximo la producción de datos. En este paso se utilizan el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004) y el material complementario Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003). MinKNOW identifica las bases y alinea los datos; los datos de salida en formato BAM se analizan con el flujo de trabajo wf-human-variation, que utiliza los programas Sniffles2, Clair3 y modbam2bed en la identificación de variantes estructurales (SV), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y la detección de metilación de ADN.

†Nota: Si no se tiene acceso a Megaruptor y se omite este paso, es probable que se observe una disminución de la cobertura de ~40× a ~30×.

Pasos del proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

• Extraer la muestra de partida (células).
• Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
• Descargar el programa que obtendrá y analizará los datos.
• Verificar la celda de flujo y comprobar que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la muestra

Mediante el método de extracción detallado, extraer el ADNg de las células y fragmentarlo con el Megaruptor.

Comprobar la longitud, cantidad y pureza del material extraído. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales a la hora de garantizar el éxito del experimento.

Preparación de la biblioteca

La tabla siguiente resume los pasos necesarios de la preparación de la biblioteca, así como su duración y las paradas opcionales.

Preparación de la biblioteca	Proceso	Duración	Paradas opcionales
Reparación del ADN y preparación de los extremos	Reparar y acondicionar los extremos de ADN con vistas a la ligación de adaptadores	35 minutos	4 °C hasta el día siguiente
Ligación de adaptadores y purificación	Ligar los adaptadores a los extremos de ADN	55 minutos	a 4 °C (almacenamientos a corto plazo o reutilización, como las recargas de celdas de flujo) a –80 °C (un solo uso o almacenamiento a largo plazo). Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores.
Acondicionar y cargar la celda de flujo	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca	10 minutos
Lavar y volver a cargar las celdas de flujo	Detener la secuenciación. Lavar la celda de flujo con nucleasa a fin de eliminar restos de la biblioteca anterior y desbloquear los poros. Acondicionar la celda de flujo, volver a cargar la biblioteca y reanudar la secuenciación	60 minutos

Secuenciación y análisis

Pasos:

• Empezar el experimento de secuenciación con el programa MinKNOW, que recopilará los datos sin procesar del dispositivo y los convertirá en lecturas identificadas.
• Analizar los datos con el flujo de trabajo wf-human-variation.

En este flujo de trabajo completo, en la fase de preparación de muestras, recomendamos extraer ADNg de gran peso molecular de 5×10⁶ de células (por ejemplo, de cultivo celular o muestra de tejido) con el kit Puregene Cell de QIAGEN.

Hay otros protocolos de extracción disponibles, pero Oxford Nanopore no los ha probado.

Cómo realizar el control de calidad del ADN de partida

Es importante que el ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), afecta a la preparación de la biblioteca.

En el protocolo Input DNA/ RNA QC encontrará las instrucciones necesarias.

Contaminantes químicos

Según cómo se extraiga el ADN de la muestra original, ciertos contaminantes químicos quedan en el ADN purificado y afectan tanto a la eficacia de la preparación de la biblioteca como a la calidad de la secuenciación. Hay más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha evaluado otras alternativas.

Preparar los reactivos de otros fabricantes siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos comprobar el número de poros disponibles presentes en la celda de flujo, en un plazo de 12 semanas desde la compra de las celdas de flujo PromethION. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Las instrucciones de comprobación de celdas de flujo se encuentran en el documento Flow Cell Check.

Celdas de flujo	Cantidad mínima de poros activos cubierta por la garantía
PromethION	5 000

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., y se guarda junto con el kit, a –20 °C, sin perjudicar su estabilidad.

Nota: el reactivo DNA Control Sample (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb que se alinea con el extremo 3’ del genoma Lambda.

Superposición de perfiles de longitud de fragmentos de a) ADNg extraído con el kit Puregene Cell, b) ADNg extraído y fragmentado con Megaruptor 3 (MR).

En este método, la celda de flujo se lava tras 30 h, con el fin de restablecer los poros y garantizar una adquisición de datos eficaz.
Por eso se creó suficiente biblioteca para cargar 2 celdas de flujo, en la fase de ligación del adaptador.

• Este lavado tiene por objeto eliminar la mayor parte de la biblioteca inicial y desbloquear los poros, de modo que la celda de flujo esté lista antes de cargar la siguiente biblioteca.
• La adquisición de datos en MinKNOW debe interrumpirse durante el lavado y la carga de la biblioteca.
• Una vez finalizado el lavado, es posible cargar la siguiente biblioteca.

El número de poros utilizables se muestra en el gráfico de actividad o en el de los resultados de la exploración.

A continuación se presentan datos de ejemplo sobre el estado de los poros, observado en una celda de flujo antes y después de realizar los pasos de lavado. Además, es posible observar un ejemplo de los datos de secuenciación acumulados, incluyendo los pasos de lavado y recarga. Los asteriscos rojos indican los lavados y recargas realizados.

Figura 1. Estado de los canales durante 72 horas de funcionamiento. Los lavados de las celdas de flujo están incluidos en el método, con el fin de restablecer los poros bloqueados y permitir una adquisición continua de datos. Los asteriscos rojos indican que se ha realizado un purgado.

Figura 2. Datos de secuenciación acumulados durante una ejecución de 72 horas. Los asteriscos rojos indican que se ha realizado un purgado.

Figura 3. Perfil de longitudes de lectura de una biblioteca con un N50 de 15 kb. La forma casi gaussiana es característica del ADNg tras la fragmentación con Megaruptor.

En él se muestra cómo lavar una celda de flujo tras un experimento de secuenciación y cómo cargar una nueva biblioteca.

El programa MinKNOW se encarga de la gestión del dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real.

Con dispositivos P2 Solo o P24/48, recomendamos identificar las bases en tiempo real con el modo de gran precisión HAC y seleccionar BAM como formato de salida.

Es preciso generar archivos en este formato, ya que es el que requiere el flujo de trabajo wf-human-variation.

Consulte en los enlaces a continuación las instrucciones de configuración del dispositivo y el experimento de secuenciación:

• PromethION 24/48: "Iniciar un experimento de secuenciación con PromethION 24/48"

• PromethION 2 Solo: "Iniciar un experimento de secuenciación con PromethION 2 Solo"

A continuación indicamos los parámetros de secuenciación recomendados en MinKNOW.

Con muestras de partida de 15 kb, recomendamos ampliar la duración de la secuenciación a 72 h, con el lavado de la celda de flujo incluido, utilizar la opción de bases modificadas al identificar las bases y seleccionar BAM como formato de salida. Los demás parámetros se dejan en la configuración predeterminada. A continuación presentamos nuestras recomendaciones actuales:

Posiciones

Posición de celda de flujo: [Definida por el usuario]

Nombre del experimento: [definido por el usuario]

Tipo de celda de flujo: FLO-PRO114M

ID de la muestra: [definido por el usuario]

Kit

Selección del kit: Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114)

Configuración del experimento

Secuenciación y análisis

Identificación de bases: Activado [predeterminado] Bases modificadas: Activado, con la opción "Contextos CG 5mC y 5hmC" seleccionada Modelo: Identificación de bases de gran precisión (HAC) [predeterminado]

Adición de códigos de barras: Desactivado [predeterminado]

Alineamiento: Desactivado [predeterminado]
Actualmente no recomendamos realizar el alineamiento en tiempo real durante la secuenciación, ya que ralentiza el procesamiento del sistema.

Muestreo adaptativo: Desactivado [predeterminado]

Opciones avanzadas Selección de canales activos: Activado [predeterminado] Intervalo entre escaneos de poros: 1,5 [predeterminado] Reservar poros: Activado [predeterminado]

Objetivos de datos

Duración máxima de la ejecución: 72 horas [predeterminado]

Archivos de salida

Formato de archivos de salida POD5: Activado [predeterminado] FASTQ: Activado [predeterminado] BAM: Activado

Filtrado: Activado [predeterminado] Puntuación de calidad (Qscore): 9 [predeterminado] Longitud mínima de lectura: 200 bp [predeterminado]

En este tipo de análisis, recomendamos utilizar el flujo de trabajo wf-human-variation, una solución bioinformática completa, desarrollada con el lenguaje de flujos de trabajo Nextflow, que incluye métodos de identificación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y variantes estructurales (SV), así como de elaboración de informes sobre la metilación del ADN.

Este flujo de trabajo conviene ejecutarlo desde el archivo BAM, que MinKNOW produce cuando en la identificación de bases se selecciona el modelo de bases modificadas. Si MinKNOW no alinea las lecturas con el genoma de referencia, recomendamos identificar las bases con el flujo de trabajo wf-basecalling. Guarde los resultados en formato BAM mediante la opción --output_bam.

Las siguientes herramientas se utilizan en el flujo bioinformático y se ejecutan de forma independiente o en conjunto:

1. Sniffles2 identifica variantes estructurales (SV) y genera archivos de salida que incluyen un informe HTML con parámetros de control de calidad, así como un archivo VCF con una lista de variantes y sus índices de calidad.

2. Clair3 identifica polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y genera archivos de salida que incluyen un informe HTML con parámetros de control de calidad, así como un archivo con una lista de variantes y sus índices de calidad.

3. modkit extrae la información de metilación del archivo BAM, que el sistema resume en un archivo en formato BEDmetil.

El flujo de trabajo wf-human-variation está preconfigurado con parámetros precisos y solo requiere elegir el genoma de referencia y el modelo Clair3. Encontrará más información en la documentación del proyecto.

Los resultados del flujo de trabajo wf-human-variation se estudian más a fondo en un navegador genómico con visualización por pistas, como IGV y se evalúan mediante un programa de análisis terciario que determina si presentan una patogenicidad conocida.

El flujo de trabajo wf-human-variation se ejecuta con el programa Nextflow.

Recomendamos realizar el análisis con EPI2ME, ya que facilita los análisis bioinformáticos al permitir la ejecución de flujos de trabajo de Nextflow desde la interfaz gráfica de usuario (GUI). EPI2ME contiene un conjunto de flujos de trabajo bioinformáticos, seleccionados y revisados de forma continua por expertos en análisis de lecturas largas, que es posible consultar en este enlace.

Si es la primera vez que usa esta interfaz, en la guía de inicio rápido se explica cómo utilizarla.

Los resultados del flujo de trabajo principal incluyen:

• un archivo VCF comprimido con gzip que contiene los SNP del conjunto de datos indicado mediante --snp;
• un archivo VCF comprimido con gzip que contiene las variantes estructurales (SV) del conjunto de datos indicado mediante --sv;
• un archivo bedMethyl comprimido que agrupa los recuentos de bases modificadas indicados mediante --mod;
• un informe HTML que describe los resultados principales del flujo de trabajo, incluidas las métricas de control de calidad y la identificación de SNP y variantes estructurales;
• si se proporciona un archivo BAM sin alinear, el flujo de trabajo generará un archivo CRAM con los alineamientos utilizados en la posterior identificación de variantes.

Resultado del flujo de trabajo secundario:

• los resultados de mosdepth incluyen:
  • {sample_name}.mosdempth.global.dist.txt: una distribución acumulada que indica la proporción del total de bases correspondientes a cada secuencia de referencia y al conjunto de ellas.
  • {sample_name}.regions.bed.gz: la cobertura media de cada región en el archivo BED proporcionado.
  • {sample_name}.thresholds.bed.gz: el número de bases de cada región cuya cobertura alcanza o supera cada uno de los valores umbral (1, 10, 20, 30×).

• los archivos de salida generados por bamstats incluyen:
  • {sample_name}.readstats.tsv.gz: un archivo TSV comprimido con gzip, que resume las estadísticas de alineamiento generadas por bamstats.
  • {sample_name}.ftagstats.tsv: un archivo de texto con un resumen de las estadísticas de alineamiento correspondientes a cada secuencia de referencia.

Con la opción --phased, se establece la fase de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), las variantes estructurales (SV) y las bases modificadas.

La precisión en la identificación de SV aumenta cuando se indica, mediante --tr_bed, un archivo BED de repeticiones en tándem, correspondiente al genoma de referencia.

La agrupación de las identificaciones de metilación mediante --mod requiere haber identificado las bases con un modelo que contemple modificaciones de bases y genere las etiquetas BAM MM y ML. En MinKNOW, comprobar que durante la configuración de la identificación de bases estén seleccionados la opción «Bases modificadas» y el modelo «5mC» seleccionado.

Guardar la referencia de entrada durante la identificación de bases o el alineamiento, ya que no es posible leer archivos CRAM sin la referencia de entrada correspondiente.

Encontrará una lista completa de los modelos de identificación de bases a disposición, en la documentación de Dorado.

Debido a la prolongada duración de la secuenciación, así como a los múltiples lavados y repetidas recargas de la biblioteca que se realizan, no recomendamos reutilizar las celdas de flujo.

Reutilizarlas en experimentos posteriores provoca que se generen datos insuficientes, lo que dificulta su análisis.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop del ADN con una relación OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento Contaminants. Probar con otro método de extracción que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza con microesferas AMPure.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra deben estar bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	En el paso de lavado se utilizó etanol en una concentración inferior al 70 %	Si se utiliza etanol a una concentración inferior al 70 %, el ADN se eluye de las microesferas. Compruebe que utiliza el porcentaje correcto.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo.	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos.	Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas de aire que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, son capaces de desplazarse hacia la matriz de nanoporos y dañar los nanoporos expuestos al aire de manera irreversible. En el vídeo Cómo cargar una celda de flujo PromethION se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo.	La celda de flujo no está colocada correctamente.	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede (GridION/PromethION), probar con una posición diferente.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros.	El recuento de poros durante la evaluación de la celda de flujo se efectúa utilizando las moléculas de ADN del control de calidad presentes en el amortiguador de almacenamiento. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca a fin de calcular el número de poros activos. Por este motivo, se estima que existe una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación suele estar relacionado con la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. En algunos casos, recomendamos emplear métodos alternativos de extracción o purificación de ADN/ARN que mejoren la pureza del material de partida. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción diferente que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema persiste, reúna los archivos de registro de MinKNOW y contacte con el departamento de Asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica, que le proporcionará instrucciones de almacenamiento adicionales.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poros inferior al 40 %	No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo	En protocolos de secuenciación de genoma humano, deben cargarse entre 200 y 300 ng de biblioteca de buena calidad en una celda de flujo R10.4.1, a fin de mantener la ocupación de poros elevada.
Ocupación de poros próxima a 0	Se utilizó el kit de secuenciación por ligación y los adaptadores no se ligaron al ADN	En la fase de ligación del adaptador, añadir la cantidad recomendada de NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el amortiguador Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit SQK-LSK114. Preparar una biblioteca de control con Lambda y comprobar la integridad de los reactivos de otros fabricantes.
Ocupación de poros próxima a 0	Se utilizó el kit Ligation Sequencing y en la fase de lavado, después de ligar el adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).	El etanol desnaturaliza la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poros próxima a 0	No hay anclaje en la celda de flujo	Los anclajes se añaden durante el acondicionamiento de la celda de flujo (tubo FCT). Añadir FCT al vial FCF antes de acondicionar la celda de flujo.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN tiende a fragmentarse durante la extracción y la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de longitudes de los fragmentos del ADN de partida en un gel de agarosa antes de continuar con la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene un elevado peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex al mezclar los reactivos. Dar suaves golpecitos al tubo con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no utilizables (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) El gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros «no utilizables» conforme pasa el tiempo.	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se eliminan de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW; si da resultado, el estado del poro pasa a "poro en secuenciación". Si la porción poros no utilizables se mantiene elevada o aumenta: 1. Es posible realizar un enjuague con nucleasa con el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004), o 2. Realizar varios ciclos de PCR a fin de diluir cualquier contaminante que esté causando problemas.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no utilizables (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad. Los poros o membranas han sufrido daños irreversibles)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca provocan daños permanentes. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION.
Gran proporción de poros inactivos o no utilizables	Ciertos compuestos copurificados con ADN	Ciertos compuestos, incluyen polisacáridos. 1. Purificar con el kit PowerClean Pro de QIAGEN. 2. Realizar una amplificación del genoma completo a partir de la muestra original de ADNg con el kit REPLI-g de QIAGEN.
Gran proporción de poros inactivos o no utilizables	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento técnico Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar hasta que las clavijas del conector estén firmemente en contacto con el dispositivo. Si el problema persiste, contacte con el servicio de Asistencia técnica.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje «Error al intentar alcanzar la temperatura deseada»	El dispositivo se colocó en una ubicación con una temperatura ambiente inferior a la media o con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW establece un tiempo para que la celda de flujo alcance la temperatura fijada. Una vez acabado ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta suele provocar una disminución en el rendimiento y generar índices de calidad Q score menores. Corregir la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reiniciar el experimento en MinKNOW.